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ctDNA监测有望为晚期ER+乳腺癌治疗耐药后进展提供早期预警。
过去十年中，晚期雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌取得了重大进展[1]。内分泌治疗及细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂（CDK4/6i）的发展和应用显著提升了患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS），但耐药性仍然难以避免[2-4]。PI3K/AKT/mTOR（PAM）信号通路的过度激活可能是内分泌治疗、化疗以及靶向治疗耐药的重要机制之一，其与患者的不良预后密切相关，对临床治疗决策具有显著影响[5,6]。
肿瘤组织活检一直是临床基因组检测的金标准，但近年来随着非侵入性液体活检技术的发展，尤其是基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测，为癌症的早期发现、实时监测和个性化治疗提供了新的选择。基于此，近期一项研究通过全外显子组测序（WES）或靶向测序分析了86例ER+乳腺癌患者的配对肿瘤或血液样本，旨在确定与CDK4/6i联合内分泌治疗耐药性相关的基因组改变，并纵向跟踪ctDNA中特定突变的水平，从而早期监测乳腺癌进展[7]。
图1 研究标题截图
研究设计与方法
研究人群
研究纳入2017年至2022年期间于丹麦欧登塞大学医院接受治疗的86例乳腺癌患者。纳入标准为年龄≥18岁、组织学确诊为ER+/HER2−且不可手术的转移性乳腺癌、适合CDK4/6i和内分泌联合治疗、既往未接受过CDK4/6i治疗。患者接受随访直至发生疾病进展（PD）、死亡或截至数据检索时间（2023年1月30日）。研究者每3-6个月监测患者治疗反应，并根据实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.1）确定PD情况。
样本收集与处理
开始CDK4/6i联合内分泌治疗之前，有35例患者接受了基线空芯针穿刺活检，样本分成两部分，其中一部分用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），另一部分则保存为新鲜冷冻材料。大多数活检样本来自骨（54%），其次是肝脏、乳腺和其他部位。FFPE组织用于肿瘤评估，包括生物标志物分析和标准组织质量控制。新鲜冷冻材料用于基因组分析。
在基线和/或治疗期间，所有患者约每12周采集一次血样，并在PD时采集了最终血样，在某些情况下还采集了组织活检样本（N=5）。对于组织活检和血液样本，研究者使用Illumina NovaSeq 6000 平台进行了WES，使用SensiScreen进行靶向测序并使用TSO5000平台进行了液体活检。
图2 研究流程
试验结果
患者特征
截至数据检索日期（2023年1月30日），从86例ER+/HER2−晚期乳腺癌患者中收集了血浆和肿瘤样本（图2）。所有有配对肿瘤样本的患者（N=5/5）均纳入了WES，并随机选择了3例仅在治疗前进行肿瘤活检的患者（N=3/35）。此外，对于没有治疗前或治疗后的肿瘤组织样本但有治疗前或治疗后血样的患者（N=46），根据以下标准随机选择了5例患者进行了TSO500分析：在基线和疾病进展时采集血样，并在治疗期间至少采集一次血样。所有13例患者在分期、辅助癌症治疗和复发时间方面与总体人群相当。
此外，所有13例患者在联合CDK4/6抑制剂和内分泌治疗后均出现PD，中位进展时间为16个月（表1），但有1例患者因副作用在死亡前两个月停止CDK4/6i治疗。一例患者对联合CDK4/6i和内分泌治疗表现出原发性耐药性（定义为在转移性环境中治疗的前6个月内发生PD）。8例患者在复发时出现了两个或更多的转移灶。在13例患者中，大多数在肿瘤转移后接受了CDK4/6i联合内分泌治疗作为一线治疗（N=11），2例患者在内分泌单药治疗后接受了联合治疗作为二线治疗。13例患者中有3例在初次诊断时为IV期。WES或靶向测序显示，9例患者（69%）的组织或血样中检测到了PIK3CA突变。
表1 患者基线特征
肿瘤和ctDNA基因组分析揭示可能与联合CDK4/6i和内分泌治疗耐药性相关的突变
为了识别与联合CDK4/6抑制剂和内分泌治疗获得性耐药性相关的基因组变异，研究者对5例患者在治疗前（基线样本）和PD后获得的10个肿瘤活检样本的WES数据进行了成对比较。九个样本成功测序，一个活检样本被污染，相应的患者被排除在成对比较之外（N=4）。变异等位基因频率（VAF）≥0.3且仅在基线或进展样本中独有的单核苷酸变异（SNV）如图3所示。在所有SNV中，66%是错义突变（45/68），7%（5/68）是无义突变或移码突变。尽管患者1-3在进展样本中显示出显著增加的突变数量，但未发现致病性突变。在患者4的进展样本中检测到已知的PIK3CA驱动突变p.E542K。对于没有可用肿瘤样本的患者（N=5），研究者使用TSO500靶向基因组测序比较了在基线和疾病进展后获得的ctDNA。患者5-9中，仅在基线或进展样本中独有的SNV如图3B所示，其中错义SNV占多数（51%，18/35），移码SNV占20%（7/35）（图3B）。总共识别出四个可能的致病突变，但其中两个在患者6的基线和进展样本中均存在（TP53 p.R282W和ESR1 p.D538G突变），因此可能与CDK4/6i联合内分泌治疗后的获得性耐药性无关。在患者5中，仅在进展样本中识别出TP53（p.R282W）和PIK3CA（p.E545K）的致病突变，表明这些可能是治疗过程中出现的新生突变或亚克隆，导致获得性耐药。
图3 接受CDK4/6i联合内分泌治疗患者的基线或进展样本中鉴定出的独特基因组变异
此外，研究者还通过WES确定了进展样本中独有的拷贝数变异（CNV）（图3C）。患者1、3和4的进展样本中观察到PDK1的拷贝数增加，而在基线样本中未见。患者3的进展样本还显示FGFR1/2拷贝数增加，而患者2和4的进展样本显示TOP1、AURKA和SRC拷贝数增加。PDGFRB在患者1和2的进展样本中扩增，而PDGFRA在患者3和4的进展样本中扩增。总体而言，与SNV相比，患者之间的拷贝数增加更常见。
此外，研究者还探索了在治疗前肿瘤DNA和ctDNA中检测到的基因组变异，这些变异在治疗后表现出VAF（正或负）的显著变化，这些可能与联合CDK4/6抑制剂和内分泌治疗的耐药性有关（图4）。与耐药性相关的变异的VAF预计在治疗期间增加，表明耐药亚克隆的选择性生长。尽管识别出的多数变异在基线和进展样本之间变化不大，但观察到患者1的SLIT2突变以及患者2的IL10RA、GNB1L、P4HB和ESPNL突变的VAF显著增加。在患者3中观察到PADI6、SIRT6、PIM3和TP53突变的VAF显著增加。值得注意的是，识别出的TP53突变（p.F270C）可能是致病性的。此外，患者4的TUBGCP6和CASC3突变以及患者6的KAT6A突变在进展后也显著增加。其余患者（患者7-9）识别的变异显示频率恒定或减少，例如患者7的NCOR1突变以及患者8的CBL和KRAS（p.T50I，非致病）突变观察到最显著的VAF降低。患者2、3和8展示了致病性的PIK3CA突变，但其在基线和进展样本中的突变频率相似。患者9中识别的致病性ERBB2突变 （p.D769Y）在基线和进展样本之间频率没有变化。
总的来说，一些患者在肿瘤进展后获得了TP53和PIK3CA的驱动突变，这可能与CDK4/6i联合内分泌治疗的耐药性有关。此外，在进展肿瘤样本中观察到几个与肿瘤生长相关的基因发生扩增，表明它们可能有助于CDK4/6i联合内分泌治疗的获得性耐药性。
图4 CDK4/6i联合内分泌治疗后不同基因突变VAF的变化情况
PIK3CA突变可用于在ctDNA连续血样检测中监测疾病进展
由于在9对样本中（患者2、3、4、5和8的基线和PD样本）以及在仅在PD时有肿瘤样本的1例患者（患者11）和仅在基线有肿瘤样本的3例患者（患者12、13和14）中通过WES和TSO500检测到PIK3CA突变，研究者试图确定是否可以通过在治疗期间采集的ctDNA连续血样中追踪PIK3CA突变以监测疾病进展。总体而言，观察到在9例通过WES和TSO500识别的PIK3CA突变患者中，7例（78%）在CDK4/6i联合内分泌治疗期间突变VAF逐渐增加（图5）。重要的是，在患者2、3、11和12中，PIK3CA突变频率分别在进展前17、4、13和5个月显著增加。此外，还观察到1例患者（患者8）基线时PIK3CA突变频率很高，但逐渐减少，最终在进展样本中仅有细微增加，表明PIK3CA突变在扩展的亚克隆中未表达。
图5 CDK4/6i联合内分泌治疗前和治疗期间收集的患者连续血液样本中PIK3CA突变VAF的变化
患者独有的特异性突变也可用于在ctDNA连续血样检测中监测疾病进展
为了评估是否可以使用个体患者的其他特定突变来早期监测疾病进展，研究者还评估了在疾病进展样本中频率增加的选定突变（图3），并特别关注了可能与联合CDK4/6i和内分泌治疗耐药机制相关的突变。研究者测试了患者1和2的进展肿瘤样本中通过WES识别的SLIT2突变，以及患者2基线和进展肿瘤样本中发现的GATA3突变（图3）。在患者1进展前3个月采集的血样中观察到SLIT2 VAF增加（图6）。同样，在患者2进展前3个月采集的血样中也发现了SLIT2 VAF增加（图6）。对于患者2的GATA3突变，基线血样中未检测到，但在进展前17个月的血样中观察到GATA3 VAF增加，这与PIK3CA突变增加的时间一致（图5）。
图6 CDK4/6i联合内分泌治疗前或治疗期间收集的患者连续血液样本中SLIT2和GATA3突变VAF的变化
总结与展望
综上所述，研究结果支持使用克隆变异（如PIK3CA突变）和患者特异性突变的连续ctDNA分析来实时监测CDK4/6抑制剂反应和早期监测PD。研究通过液体活检分析了联合治疗进展后出现的致病性突变（如TP53 p.R282W和PIK3CA p.E545K等）和基因扩增（如PDK1、AURKA、TOP1和SRC等）。值得注意的是，PIK3CA突变在疾病进展前3-17个月就可通过ctDNA检测到，相比传统影像学检查或能更早期预测患者PD。
目前临床中，针对PIK3CA突变以及PAM通路其他相关突变的研究也正在如火如荼地开展，由于PAM信号通路的异常激活与不良预后和CDK4/6i以及内分泌治疗耐药紧密相关，针对这一通路的早期检测和精准治疗也显得尤为重要。随着多种PAM通路抑制剂显示出对PIK3CA突变乳腺癌患者的显著疗效，此次研究结果或能为早期基因检测及精准用药策略提供重要参考。此外，检测时机对于晚期或转移性乳腺癌患者也至关重要，本研究也证实了ctDNA分析的优势，有助于早期识别与PD相关的基因变异，从而更好指导临床治疗决策。
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参考文献：
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审批编号：CN-146487 过期日期：2025-10-30
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