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前言
RAF激酶家族是促肿瘤有丝分裂原活化蛋白激酶途径的关键激活剂。RAF激酶家族中的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶（ARAF、BRAF和CRAF）通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径向下游传递信号，以调节参与控制各种细胞机制的基因转录。RAF蛋白，特别是BRAF和CRAF的过度激活，在许多类型的癌症中驱动肿瘤进展和耐药性。
BRAF突变导致组成型激酶激活，可在多种癌症中检测到，最显著的是甲状腺癌、黑色素瘤和结直肠癌。目前，有许多获批的针对BRAF突变肿瘤的BRAF靶向疗法，通常与MEK抑制剂联合使用，以最大限度地抑制MAPK通路并延缓耐药性。此外，KRAS抑制剂的发现和批准，也在临床试验中显示了极具前景的结果。
然而，尽管已经有了BRAF V600和KRAS G12C突变癌症的治疗策略，但仍有许多MAPK活化癌症患者没有明确的靶向治疗策略。最近，人们越来越关注癌症中的RAF1的突变，其编码CRAF。在MAPK通路改变的肿瘤中，CRAF正在成为对MAPK靶向治疗耐药的关键分子。随着下一代测序在临床上的应用越来越广泛，致癌的RAF1改变在患者肿瘤中越来越多地被发现，专门针对这类致癌突变的药物正在出现，有望在临床上得到应用。
CRAF的结构和活化
CRAF是一种75kDa的蛋白激酶，在哺乳动物组织中广泛表达。RAF蛋白家族共有三个保守区：CR1、CR2和CR3。CR1包含RAS结合结构域（RBD）和富含半胱氨酸的结构域（CRD），它们结合RAS。CR2结构域包含14-3-3蛋白相互作用结构域和一个重要的抑制性磷酸化位点（S259），该位点将CRAF维持在自动抑制状态。CR1和CR2位于CRAF的N-末端调控区。C末端CR3包含激酶结构域和14-3-3的额外结合位点（S621）。CR3中含有几个激活磷酸化位点，并被不同的激酶靶向以激活CRAF。
CRAF激酶活性的调节是一个复杂的过程，涉及几种蛋白-蛋白相互作用及其细胞定位和磷酸化状态的变化。在失活状态下，CRAF在细胞质中以单体、自动抑制状态存在。抑制状态由CRAF上的几个抑制性磷酸化位点维持：S43的磷酸化通过空间位阻阻断CRAF与RAS的结合，S233和S259的磷酸化将蛋白复合物14-3-3募集到CR2，阻止CRAF与质膜的结合。
在有丝分裂信号的下游，当RAS被激活时，它触发CRAF向质膜的募集，随后激活。RAS对RBD具有高亲和力，但CRAF激活需要RAS与CRD的额外相互作用。此外，CRD与质膜中的磷脂相互作用，有助于从抑制状态释放，并稳定与RAS的相互作用。在这个过程中，RAS从pS259置换14-3-3，使其可接近蛋白磷酸酶1（PP1）和/或蛋白磷酸酶2A（PP2A），介导其去磷酸化。RAS结合还诱导CRAF的构象变化，释放N-端和C-端结构域之间的内部自抑制相互作用，促进CRAF的“开放”构象，并通过多种激酶促进C-端催化结构域中激活位点的磷酸化，包括S338、Y341、T491和S494。此外，CRAF活化还涉及二聚化。目前的证据表明，野生型RAF蛋白需要RAS和募集到质膜进行二聚化，一些致癌BRAF突变体在细胞质中以RAS独立和组成的方式与CRAF异二聚化。
CRAF的致癌作用
RAF1已被表征为人类致癌基因，CRAF蛋白的过度激活是上游信号蛋白（如RAS和生长因子受体）致癌激活肿瘤的常见特征。
CRAF的典型致癌作用是由MAPK通路信号传导介导的，这通常与其激酶活性和激活周期有关。许多研究已经证明CRAF在多种癌症背景下调节ERK磷酸化的能力。在这些情况下，CRAF最终通过下游激活pERK的许多促肿瘤靶点来促进癌症的发生和发展。除了这种典型途径外，CRAF还可以以不涉及其激酶活性的MAPK独立方式促进癌细胞的存活、增殖和迁移。
CRAF的激酶非依赖性作用首次在对Raf1敲除小鼠的研究中得到证实。CRAF在胚胎发生、血管形成和细胞存活过程中具有重要的激酶非依赖性作用。试验表明，CRAF在调节细胞凋亡中具有与MAPK通路无关的功能。CRAF可以转移到线粒体，在那里它磷酸化并失活促凋亡蛋白BAD。此外，CRAF可以直接结合并抑制促凋亡蛋白ASK-1和MST-2。CRAF还可以通过不同的机制调节细胞周期的进展。CRAF与肿瘤抑制因子RB相互作用并促进E2F的释放。CRAF还通过在G2/M转变期间在中心体和有丝分裂纺锤极与极光激酶a和极样激酶1（PLK1）的相互作用促进小鼠胚胎成纤维细胞和人类结直肠癌细胞系HCT116中的有丝分裂进展。
RAS原癌基因家族（主要是KRAS、NRAS和HRAS）内的激活突变发生在约30%的所有癌症患者中，并导致MAPK和PI3K信号通路的组成性激活。尽管BRAF是野生型RAS下游的主要RAF亚型，但多项研究表明，RAS突变癌症将这种依赖性转变为CRAF。此外，体外研究表明，不同的RAS亚型具有不同的激活CRAF的能力。KRAS G12V比HRAS G12V106更有效地诱导CRAF向质膜的募集和下游MAPK途径的激活。CRAF结合亲和力和下游ERK磷酸化在不同的RAS突变体中具有广泛的可变性，这表明RAS突变可以通过MAPK依赖性和MAPK非依赖性的方式诱导肿瘤的发生和转移。
即使在具有野生型RAS的肿瘤中，CRAF也是肿瘤进展所必需的。在缺乏RAS突变的人类肾细胞癌（RCCs）中，在55%的病例中观察到CRAF的过度磷酸化，表明CRAF在这种癌症类型中的主要致癌作用。类似地，RAF1过表达还发生在50%的人肝细胞癌（HCC）中，并与CRAF活性增加有关。
CRAF的致癌改变
目前，已在癌症患者中鉴定出肿瘤原性RAF1改变（扩增、融合和突变）。这些改变发生的频率低于致癌的BRAF改变，但在患者的肿瘤中越来越多地被发现。因此，有必要表征RAF1的各种变化，以进一步了解致癌CRAF的生物学效应和潜在的治疗意义。
RAF1的扩增在膀胱癌中最常见，在黑色素瘤、乳腺癌、胃食管癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌和嗜铬细胞瘤中也观察到一定频率。RAF1融合最常见于毛细胞星形细胞瘤亚群和0.5-1%的前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌。在毛细胞星形细胞瘤中，SRGAP3–RAF1融合最常见；在前列腺癌中，常见ESRP1–RAF1融合。所有的RAF1融合都失去了CRAF的N末端自身抑制结构域，并将致癌C末端结构域与由高表达启动子调控的基因偶联，导致融合蛋白的过表达。
RAF1的激活突变发生频率（~0.7%）远低于激活BRAF突变（~8%）。这种差异可能归因于CRAF的基础激酶活性低于BRAF。最常见的致癌RAF1突变是S257L，其次是密码子S259和P261的突变。这三个突变体聚集在CR2中，导致关键的自身抑制位点S259的磷酸化显著降低。此外，CRAF的蛋白激酶结构域内还有多个额外的复发致癌突变，包括R391、G361和E478。除了CR2和蛋白激酶结构域的突变外，在人类肿瘤中还发现了其他RAF1突变，如K106R和L613V。
CRAF在治疗反应中的作用
新出现的证据表明，CRAF代表了对许多MAPK靶向疗法的治疗耐药性的关键节点。事实上，BRAF依赖性肿瘤可以转变为CRAF依赖性，作为对BRAF靶向治疗的抵抗机制。多个致癌RAF1突变（G361A、S257P、P261T和R391W）已被证明对BRAF V600E抑制剂vemurafenib具有耐药性。
截短的RAF1通过与RAF1融合相同的机制，在体外显示出在癌症细胞中赋予对MET靶向治疗和EGFR靶向治疗的耐药性。这可能是由于截短的RAF1介导的MAPK通路的过度激活。RAF1融合和突变也与对新型KRAS G12C抑制剂的耐药性有关。通过多种机制维持CRAF激活是所有KRAS G12C抑制剂抗性细胞系的共同特征。KRAS G12C抑制剂已被批准用于治疗KRAS G12C-突变型肺癌，随着KRAS抑制剂在临床开发中的进展以及BRAF和MEK抑制剂越来越多地用于更广泛的癌症类型，CRAF介导的对MAPK抑制剂的耐药性将在临床实践中变得越来越普遍。需要进一步的研究来测试和开发治疗策略，最大限度地减少CRAF介导的MAPK抑制剂耐药性，并为新发或获得性CRAF依赖性肿瘤开发最佳疗法。
CRAF突变肿瘤的潜在治疗策略
直接抑制致癌驱动因素的改变通常是癌基因驱动肿瘤最有效的靶向治疗策略。泛RAF抑制剂是一类新的MAPK抑制剂，可以抑制野生型和突变型BRAF以及野生型CRAF。因此，这些泛RAF抑制剂代表了靶向RAF1改变肿瘤的有前景的新疗法。
与BRAF抑制剂（如vemurafenib）不同，泛RAF抑制剂不会在BRAF野生型或RAS突变细胞中引起MAPK途径的异常激活。此外，与前几代激酶抑制剂如索拉非尼和瑞戈非尼相比，泛RAF抑制剂是CRAF和BRAF的更特异性抑制剂。目前，许多新型泛RAF抑制剂正处于早期临床开发阶段，用于治疗RAS或BRAF突变肿瘤。
这些泛RAF抑制剂中的大多数目前也在评估是否与其他靶向疗法，如MEK、ERK、EGFR和CDK4/6抑制剂或免疫疗法（抗PD1单克隆抗体）联合使用。最近报道了泛RAF抑制剂纳波拉非尼和MEK抑制剂曲美替尼联合应用的I期试验结果，该试验在NRAS突变黑色素瘤患者中具有良好的抗肿瘤活性。
小结
CRAF是一种蛋白激酶，它的突变和过度激活驱动癌症的进展和治疗耐药性。临床实践中越来越多地发现癌症患者中的RAF1改变，但目前，对于RAF1改变的肿瘤，还没有标准的治疗方法。然而，幸运的是，有大量新的临床前和临床证据表明，多种新的靶向治疗方法与MAPK通路抑制剂的新组合对RAF1改变的肿瘤具有疗效。这些新抑制剂的可用性和有效性突出了CRAF作为癌症治疗靶点的潜力。
参考文献：
1. The role of CRAF in cancer progression: from molecular mechanisms to precision therapies. Nat Rev Cancer. 2024 Jan 9.
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