随着全球范围内抗生素耐药感染的不断增加，加之新抗生素开发的艰巨性，推动了噬菌体疗法的开发与应用。然而，在噬菌体治疗过程中依然面临许多挑战，例如噬菌体能否逃脱细菌的层层防御而发挥杀菌作用，将直接影响到噬菌体制剂的疗效。因此，挖掘并解析噬菌体逃逸细菌防御的分子机制显得尤为重要。
2024年11月6日，经过深圳市转化医学研究院（深圳大学第一附属医院）、武汉大学、深圳市儿童医院紧密合作，陈实团队在Nature Microbiology在线发表了题为A widespread phage-encoded kinase enables evasion of multiple host antiphage defense systems的研究成果，揭示了噬菌体通过编码广泛存在的蛋白激酶来拮抗细菌多重防御系统。这是陈实团队在深入发掘微生物表观遗传的化学生物学及其感应防御系统的分子机制等工作基础上，进一步拓展到了细菌与噬菌体互作领域。
陈实团队致力于挖掘微生物表观遗传及其感应防御系统。基于DNA磷硫酰化（phosphorothioate，PT）修饰的Ⅰ型Dnd修饰防御系统，可有效抵抗外源质粒或噬菌体的入侵，以维持细菌遗传稳定性【1】。DndABCDE蛋白可将来源于半胱氨酸的硫掺入细菌DNA的磷酸骨架中，产生序列特异性、空间构象专一性的双链磷硫酰化修饰【2】，这种特殊的DNA骨架磷硫酰化修饰广泛存在于细菌【3】和古菌【4】中。单分子实时测序和单分子成像研究显示，细菌磷硫酰化修饰是一种不饱和的部分修饰，基因组中仅有12 - 14%的潜在位点会被修饰【5,6】。此外，磷硫酰化系统还可与甲基化形成基因组甲基硫化的双修饰，并与基于甲基化修饰的R-M系统存在相互作用和干扰【7,8】，并参与调节基因表达和细胞代谢【9】。
有意思的是，细菌DndABCDE-DndFGH 组成的磷硫酰化防御系统中 DndFGH 限制蛋白复合物通过水解ATP供能，经过构象变化激活DNA缺刻酶和易位酶活性，使其在外源非修饰DNA上滑动并引入缺口，从而限制了外源遗传物质在宿主内的复制，行使了外源DNA或噬菌体的防御功能。而DndFGH复合物对磷硫酰化修饰有更强的亲和性，使其可以优先结合到自身基因组DNA上的磷硫酰化修饰位点，但蛋白的易位酶和核酸酶活性均受到抑制，因而避免了对宿主的自身免疫，从而从分子水平揭示了基因组磷硫酰化修饰对DndFGH复合物介导的限制系统的调控机制【10】。Ⅱ型SspABCD是一种单链磷硫酰化修饰系统，在基因组特定位点的单链上引入修饰【11】，与磷硫酰化感应切口酶SspE结合形成一种新的防御屏障【12】。细菌磷硫酰化防御系统还被应用于抗噬菌体底盘的开发，成功建立了抵抗多种噬菌体侵染并适宜于发酵生产的合成生物学底盘【13】。
细菌磷硫酰化防御系统可以有效抵抗噬菌体的入侵，那么噬菌体是否可以对抗并逃逸该系统呢？该研究以细菌的磷硫酰化防御系统为切入点，从环境中分离了逃逸噬菌体JSS1。基于系统性的基因敲除，精准定位出导致噬菌体逃逸Dnd防御系统的拮抗基因，由此鉴定出了噬菌体anti-Dnd系统。
该拮抗蛋白JSS1_004广泛存在于不同噬菌体中，具有蛋白激酶活性，能够磷酸化修饰丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。基于蛋白磷酸化组分析，JSS1_004可以磷酸化细胞中超过300个蛋白。对于Dnd防御系统，JSS1_004通过磷酸化修饰改变DndFGH蛋白复合物的空间构象，干扰其对底物DNA的结合活性、ATP水解酶活性、DNA易位酶活性以及DNA切割活性，从而使Dnd防御系统丧失对噬菌体的抵抗能力。与以往细菌防御系统通过磷酸化修饰抵抗噬菌体的作用不同，该研究揭示出噬菌体反过来通过编码激酶蛋白来磷酸化修饰发挥对抗作用而逃逸细菌防御系统。
令人惊讶的是，JSS1_004还可以磷酸化细胞中I-E型CRISPR-Cas系统中的CasD蛋白，同时干扰了CRISPR-Cas系统在获取阶段和效应阶段对噬菌体的识别和限制作用，拓展了对CRISPR-Cas系统拮抗的分子机制。除了CRISPR-Cas获得性免疫系统，拮抗蛋白JSS1_004通过磷酸化修饰，还可以逃逸QatABCD、SIR2+HerA和DUF4297+HerA先天性免疫系统。尽管这些细菌防御系统的作用机制各不相同，但都能被JSS1_004磷酸化修饰而抑制，展现出该逃逸系统宽泛的拮抗作用，为未来开发高效杀灭病原菌的工程化噬菌体提供了新的方向。
噬菌体编码蛋白激酶磷酸化修饰并逃逸细菌的多重防御系统
综上，陈实团队在噬菌体中发现了一种广泛存在的新型拮抗系统，该系统通过磷酸化修饰逃逸细菌的多重防御系统，从而实现对细菌的高效杀灭。该生物学机制的解析不仅启发了我们针对细菌其它防御体系的拮抗系统挖掘，拓展了对细菌和噬菌体间相互作用和军备竞赛的理解，同时也为未来噬菌体治疗中工程噬菌体的设计和改造提供了新的方向。
陈实教授为论文的通讯作者，蒋素素博士后和陈超研究员为该论文的共同第一作者。
原文链接： https://www.nature.com/articles/s41564-024-01851-2
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