1941年1月4日，震惊中外的皖南事变爆发了，新四军军部和直属部队九千余人奉命北调，6日行经安徽泾县茂林地区时，突然遭到国民党军队七个师八万多人的包围袭击。经过七昼夜血战，终因弹尽粮绝，除2000人突围外，大部分壮烈牺牲，军长叶挺费扣副军长项英，政治委员袁国平、副参谋长周子昆等人遇难。
逐渐被包围。
周恩来获悉新四军陷入重围时，立刻向张冲提出严重抗议，接着又向蒋介石、何应钦、白崇禧、顾祝同等分别提出抗议。当晚，他召开南方局紧急会议，研究事变发生后的局势和斗争的方针，组织力量，广泛地向国民党内主张团结抗敌的人士以及社会各方面揭露国民党顽固派的反共罪行，他还写信给蒋介石，要蒋介石命令国民党军队立即撤回给北上的新四军让路。
1月17日晚，国民党中央通讯社发布了国民政府军事委员会通令和发言人谈话，反诬新四军叛变，悍然宣布撤销新四军番号，声称要把叶挺交付军事法庭审判。周恩来立刻打电话给何应钦，通知他，你们的行为是亲者痛，仇者快。你们做了，日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人，随即驱车到国民党谈判，代表张冲处，当面提出质问和抗议。
军事法庭
为抗议国民党顽固派的暴行，周恩来为新华日报题写了充满悲愤的题词，为江南死国难者志哀和千古奇冤。江南一夜同是操戈，相煎何急，这满含悲愤的25个字，产生了震撼人心的强大力量，揭穿了皖南事变的实质，成为投向敌人的重磅炸药。为准备应付国民党顽固派更大的迫害，周恩来安排八路军办事处和新华日报社的工作人员，隐蔽和撤退。领导南方局军事组在重庆秘密散布了经他审定的新四军皖南部队惨败被围歼的真相。
并广泛地同社会各界人士接触。在外交方面，周恩来也做了大量卓有成效的工作。他与英国驻华大使卡尔、美国总统罗斯福的代表居里举行会谈，甚至动员国际舆论对蒋介石施加压力。周恩来在这些风云险恶的日子里始终战斗在第一线，并参与着中共中央的各项重大决策。
多方面展现出他的品格和才能，巧妙而又恰到好处地击退了国民党一次又一次的进攻，赢得了国民党统治区广大群众包括中间阶层的同情和信任。
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