人类神经类器官 （neural organoids） ，或脑类器官 （brain organoids） ，是一种源于人类多能干细胞的体外培养神经组织三维模型。如今，这一模型已经发展为对人类脑部发育、进化和疾病相关研究的有力工具。在神经类器官的培养过程中，可以通过使用如形态发生素 （morphogens） 等外源模式塑造因子以诱导产生代表特定脑区的特定细胞类型，而这一类培养神经类器官的实验方案被称为制导型方案 （guided protocol） ；反之，若不使用额外的模式塑造因子，而是依赖于类器官的自身模式塑造能力来决定所产生的细胞类型，则为非制导型方案 （unguided protocol） 。
迄今为止，可用于培养人类神经类器官的实验方案已经有不下数十种。然而，我们依然缺乏对这些不同神经类器官培养方案的全面比较与描述。譬如，我们尚不清楚这些不同的实验方案所产生的细胞在何种程度上覆盖人类脑部发育过程中所产生的细胞类型，也并不清楚神经类器官所产生的细胞 （特别是非大脑皮层的神经元类型） 在分子表型层面上与脑部发育过程中对应细胞类型的相似程度。
2024年11月20日，瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系 （Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich）Barbara Treutlein团队、德国慕尼黑亥姆霍兹研究中心 （Helmholtz Munich）Fabian Theis团队以及瑞士巴塞尔罗氏人类生物学研究所 （Institute of Human Biology） 、巴塞尔大学生物中心 （Biozentrum, University of Basel）J. Gray Camp团队合作于Nature发表文章An integrated transcriptomic cell atlas of human neural organoids。文章共同第一作者为Treutlein研究组高级研究员何志嵩博士 （兼共同通讯作者） 、Theis研究组博士生Leander Dony、以及Camp研究组博后Jonas Simon Fleck博士。在这一研究中，研究人员整合了36组不同的人类神经类器官单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（34组已发表，2组未发表），共计代表了26种不同的人类神经类器官培养方案，合计细胞数量超过170万。通过对这些数据进行整合分析，并建立了其与人类脑部早期发育细胞图谱的数据映射关联，研究团队对不同神经类器官培养方案所得到的神经元类型、其分化成熟程度、以及与相对应的人类脑部神经元之间的转录组差异等进行了全面的分析研究。同时，研究团队建立了全套的应用程序界面以供其他研究人员将该细胞图谱运用于其他研究，包括对新建立的神经类器官培养方案进行鉴定评价、对利用神经类器官进行疾病建模的单细胞RNA测序研究数据进行协助注释、并作为大规模对照实验组以进行量化比较。
在这一研究中，研究团队首先利用Sfaira系统对所获取的海量数据 （包括其元信息） 进行了统一的标准化处理。由于这些数据来源于不同实验室运用不同的单细胞RNA测序手段对基于不同实验方案的类器官进行的测量，因此具有高度异质化、且带有强批次效应的特点。为了更好地对数据进行整合，研究团队建立了一套数据整合策略，首先运用数据降维转化方法reference similarity spectrum【1】，进行数据预整合及聚类，然后利用新开发的基于多层次细胞类型基因标记的自动注释算法snapseed进行细胞聚类的预注释，最后使用基于变分自编码器 （variational autoencoder） 的标签感知的数据整合算法scPoli方法【2】结合预注释的结果进行最终的数据整合。基于最终的整合结果，研究团队进一步对神经类器官细胞图谱 （HNOCA，Human Neural Organoid Cell Atlas） 进行细胞类型注释。
图1 构建人类神经类器官细胞图谱HNOCA
为了对人类神经类器官与人脑早期发育进行细致全面的比较，研究团队对近期发表的人类脑部第一孕期发育的细胞转录组图谱【3】通过scANVI算法【4】进行了重新整合处理，并通过迁移学习算法scArches【5】将HNOCA中的细胞映射到人脑早期发育细胞图谱的细胞状态潜在空间中。在此基础上，研究团队开发了基于参考-查询加权k近邻二分图的分层标签转移方法，对HNOCA中的细胞、特别是非端脑神经组细胞与神经元进行了更细致的注释。同时，通过对所得到的参考-查询加权二分图进行归纳，研究团队还得以量化人类脑部早期发育中不同的细胞类型在不同神经类器官实验方案中的富集程度，从而找到了当前代表性神经类器官培养方案难以有效获得的细胞类型，其中包括了各种非神经外胚层发生的胶质细胞 （如微胶质细胞、血管内皮细胞等） 以及如丘脑网状核GABA能神经元、背侧中脑m1区GABA能神经元、m1/m2区谷氨酸能神经元等若干神经元类型。同时，通过将HNOCA与人类脑部不同发育时期的细胞图谱进行比较，研究团队还发现了在不进行异种移植的前提下，当前的神经类器官的神经元成熟程度存在明显瓶颈，即便进行超过半年乃至近一年的长期培养，其分化以及成熟程度依旧停留在原生胚胎发育的第二孕期。
图2 人类神经类器官图谱与人脑胚胎发育图谱的细胞类型匹配与比较
在协调并标准化人类神经类器官以及人脑胚胎发育图谱的神经元类型注释后，研究团队进一步对神经类器官与脑部胚胎发育过程中对应的神经元类型进行了转录组差异表达分析。研究团队得到了920个普遍差异表达基因，即在基于不同类器官实验方案的不同的神经元类型中均检测到的差异表达基因。其中，在类器官中表现出普遍高表达的基因显著富集于糖酵解等代谢过程中，显示出体外培养环境可能对类器官中细胞的代谢状态产生显著影响。这一发现与之前若干研究的发现吻合，而这一变化可能与细胞在非体内培养环境中，特别是由于缺少了血管系统的缘故，所受到的环境压力相关。而通过将所得到神经元的糖酵解通路活性与不同实验方案的实验步骤进行比较，研究团队观察到若干实验操作，如在培养过程中对类器官进行分切、使用特定的神经元成熟培养基等，可能能够有效降低类器官中细胞对环境压力产生的应激反应。同时，研究团队还发现，类器官中神经元应激反应的强弱与其跟早期发育脑部对应神经元类型的核心特征相似程度并没有显著关联，说明这一应激反应可能并没有显著影响不同类型神经元核心分子特征的建立。
人类神经类器官细胞图谱HNOCA的构建不仅可以用于对已有数据的整合分析，还可以作为大型数据资源用于协助分析新的神经类器官单细胞转录组数据。例如，研究团队对近期预印于bioRxiv的利用人类神经类器官进行大规模形态发生素筛选实验的单细胞RNA测序数据【6】进行了再分析，通过将其投影到HNOCA以及人脑胚胎发育图谱中，对其中不同的形态发生素处理条件的神经元类型产出进行了量化描述，并于HNOCA中所涵括的已有类器官实验方案产出进行了比较。
鉴于神经类器官越来越广泛地被应用于构建神经相关疾病模型，研究团队还收集并整合了11组单细胞RNA测序数据，涵括了运用神经类器官对包括头小畸型 （microcephaly） 、肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 、自闭症 （autism） 、脆性X染色体综合征 （fragile-X syndrome） 等10种不同的神经相关疾病进行建模的研究。通过将该整合疾病模型数据集与HNOCA以及人脑胚胎发育图谱进行比较，研究团队对这些疾病模型的单细胞RNA测序数据进行了重新注释。研究团队发现，在逾半数的研究中，对照组与疾病组的类器官产生了代表完全不同脑区的不同类型神经元；这意味着对其进行直接的比较很可能无法得到与疾病本身真正相关的基因表达差异。为此，研究团队基于疾病模型数据投影得到的HNOCA的参考-查询加权k近邻二分图，为疾病模型数据中的每一个细胞构建一个对应的HNOCA匹配元细胞 （metacell） ；然后，通过结合新开发的单细胞配对差异表达统计检验，研究团队建立了一套新的分析体系，在保证计算量的可伸缩性的前提下，让HNOCA成为一个可供其他研究使用的大规模的对照组单细胞转录组资源。研究团队将这一分析体系运用到其中的脆性X染色体综合征研究数据中，并成功找到了与该疾病相关的基因，从而展示了这一分析方法的可行性。
图3 神经疾病模型类器官图谱以及与HNOCA的量化比较
而对于其他未包含在当前HNOCA图谱的神经类器官数据、以及未来可能产生的新数据，研究团队还开发了HNOCA-tools这个Python的软件包，可用于将研究团队所建立的分析方法用于新的数据。该研究中所构建的HNOCA数据可以通过CELLxGENE Discover进行访问，同时这一数据以及其投影模型均可以通过Zenodo进行下载。此外，对HNOCA的图谱以及人脑胚胎发育图谱的投影还可以通过ArchMap （ https://www.archmap.bio/ ） 选取对应的投影模型来进行。
图4 用于分析神经类器官单细胞RNA测序数据的分析流程与用户接口
综上所述，这项研究通过整合不同神经类器官实验方案的单细胞转录组测序数据，构建了迄今为止最完整最大规模的人类神经类器官细胞转录组图谱，并与人脑早期发育细胞图谱中的细胞类型与状态进行了全面比较；同时，这项研究所得到的细胞图谱以及建立的分析流程框架，也为后续人类神经类器官的单细胞组学研究提供了重要的数据资源与分析流程的参考。
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08172-8
制版人：十一
参考文献
1. Kanton S, Boyle MJ, He Z, Santel M, Weigert A, Sanchís-Calleja F, et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development.Nature.2019;574: 418–422.
2. De Donno C, Hediyeh-Zadeh S, Moinfar AA, Wagenstetter M, Zappia L, Lotfollahi M, et al. Population-level integration of single-cell datasets enables multi-scale analysis across samples.Nat Methods.2023;20: 1683–1692.
3. Braun E, Danan-Gotthold M, Borm LE, Lee KW, Vinsland E, Lönnerberg P, et al. Comprehensive cell atlas of the first-trimester developing human brain.Science.2023;382: eadf1226.
4. Xu C, Lopez R, Mehlman E, Regier J, Jordan MI, Yosef N. Probabilistic harmonization and annotation of single-cell transcriptomics data with deep generative models.Mol Syst Biol.2021;17: e9620.
5. Lotfollahi M, Naghipourfar M, Luecken MD, Khajavi M, Büttner M, Wagenstetter M, et al. Mapping single-cell data to reference atlases by transfer learning.Nat Biotechnol.2022;40: 121–130.
6. Amin ND, Kelley KW, Hao J, Miura Y, Narazaki G, Li T, et al. Generating human neural diversity with a multiplexed morphogen screen in organoids.bioRxiv.2023. p. 2023.05.31.541819. doi:10.1101/2023.05.31.541819
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