羰基去饱和是有机合成中广泛使用的一种基本反应。虽然已经开发出许多方法来扩大这一重要转化的范围，但其中大多数方法都需要多步骤方案，或者需要使用高负载的金属或强氧化条件。此外，能够实现精确立体化学控制去饱和过程的方法极为罕见。
鉴于此，西湖大学叶宇轩研究员团队报告了一种生物催化平台，通过重新设计“烯”还原酶，使其高效地介导脱氢反应，即其原生活性的反向过程，从而实现环己酮的不对称脱饱和反应，生成带有远程四元立体中心的多种环己酮。这种基于“烯”还原酶的去饱和系统在温和条件下以空气作为终端氧化剂运行，可耐受氧化敏感或金属不相容的功能团，更重要的是，与使用小分子催化剂相比，它表现出无与伦比的立体选择性。机理研究表明，该反应通过α-去质子化，随后进行速率决定的β-氢化物转移进行。相关研究成果以题为“Unmasking the reverse catalytic activity of ‘ene’-reductases for asymmetric carbonyl desaturation”发表在最新一期《Nature Chemistry》上。
叶宇轩，1991年生于江苏南京。2013年于北京大学化学与分子工程学院获得学士学位，指导教师为王剑波教授和张艳教授。本科期间在美国加州大学洛杉矶分校Neil Garg教授课题组进行了暑期科研交流。2018年在美国麻省理工学院获得博士学位，指导教师为Stephen Buchwald教授。2019–2022年在美国普林斯顿大学和康奈尔大学开展博士后研究，合作教师为Todd Hyster教授。叶宇轩博士于2022年9月全职加入西湖大学理学院担任特聘研究员，主要研究方向为新型酶催化非天然反应的发展和应用。
2022年，叶宇轩以第一作者的身份发表一篇《Nature Chemistry》。他们使用依赖黄素的“烯”还原酶和外源光氧化还原催化剂，在蛋白质活性位点内选择性地生成酰胺基自由基。这些酶是通过定向进化设计的，可以催化5-外、6-内、7-内、8-内和分子间氢胺化反应，具有高水平的对映选择性。机制研究表明，自由基引发是通过酶门控机制发生的，其中蛋白质在热力学上激活底物，以便通过光催化剂进行还原。分子动力学研究表明，酶使用非规范结合相互作用与底物结合，这可以作为进一步操纵反应性的手段。这种方法证明了这些酶在控制高能自由基中间体反应性的多功能性，并强调了协同催化策略解锁以前无法实现的酶功能的机会。
【策略设计】
羰基去饱和涉及在羰基附近引入C=C键，这在有机合成中至关重要。现有的方法，包括Saegusa-Ito氧化和各种过渡金属催化反应，都受到依赖重金属、强氧化剂和多步骤程序等限制。此外，在这些转变中实现立体控制仍然是一个重大挑战。本研究重新设计了黄素依赖性“烯”还原酶（ERED），以催化其天然还原功能的逆反应。工程酶在温和条件下以空气作为末端氧化剂运行，并实现精确的立体选择性。意义在于：避免重金属催化剂和刺激性试剂。在50°C的缓冲水系统中高效运行。与传统方法相比，产生具有无与伦比的对映选择性的手性α,β-不饱和羰基化合物。
图 1. 羰基去饱和反应
【反应发现和优化】
作者首先筛选ERED库的4-甲基-4-苯基-环己酮对映选择性去饱和活性。大多数野生型酶的活性可以忽略不计，但CrS和GkOYE成为具有中等产率和对映选择性的有前途的候选酶。通过定向进化优化发现：CrS变体：诱变针对活性位点的关键残基，例如Y27。CrS1(Y27L)、CrS2(Y27C)和CrS3(Y27T)等变体显着提高了产率(79–88%)，同时保持了高对映体比率(98:2)。GkOYE变体：迭代诱变产生了GkOYE3（D73G、C26S、Y28V），其产量达到96%且>99:1er。实验结果显示：升高温度（~50°C）可增强酶活性。定向进化的重点是提高底物结合效率和提高催化速率。
图 2. CrS 和 GkOYE 酶去对称脱氢反应的发现和定向进化
【范围和限制】
进化的酶表现出广泛的底物耐受性：（1）取代的环己酮：酶可有效处理芳环上带有吸电子基团（例如氯、三氟甲基）和给电子基团（例如甲氧基、二甲氨基）的底物。（2）杂环：含有吡啶和吲哚环的化合物以高立体选择性进行去饱和。（3）烷基取代基：各种烷基，包括乙基、异丙基和烯丙基，是相容的。（4）螺环系统：具有螺环骨架的底物产生具有优异对映选择性的产物。限制体现在：具有羟基或大取代基的底物表现出较差的转化率，可能是由于空间位阻或不利的酶-底物相互作用。
图 3. 4-烷基-4-芳基环己酮去对称脱氢的范围
图 4. 其他类别环己酮的去对称脱氢范围
此外，作者对实验进行放大：使用湿裂解物和冻干裂解物，反应已成功放大至克量。例如：模型底物(6.0mmol)去饱和后，在克级反应中产生产率88%和>99:1er的产物。产品同时具备多元化：(+)-Mesembrine合成：酶产物被转化为Mesembrine（一种具有药理活性的生物碱），展示了该方法在药物合成中的实用性。Diels-Alder反应：环己烯酮经过进一步转化，形成具有高非对映选择性的复杂多环化合物。
图 5. 制备规模合成和产品衍生化
【机理研究】
作者根据实验结果，拟议机理——首先底物结合：环己酮结合在酶的活性位点内。然后α-去质子化：保守的酪氨酸残基（GkOYE3中的Y169）有助于去除α-质子，形成烯醇化物中间体(Int1)。接着发生β-氢化物转移：Int1经历氢化物转移至黄素辅因子(FMNox)，产生去饱和产物和还原黄素(FMNhq)。最后黄素再生：FMNhq与分子氧反应，再生FMNox并形成过氧化氢。
关键的实验证据证明了机理的合理性，（1）氕氘交换：在D2O中进行的反应表明，Y169对α-质子化至关重要，Y169A突变体中氘的掺入量减少就证明了这一点。（2）自由基时钟实验：支持将β氢转移作为主要机制，排除了单电子转移途径。（3）动力学研究：与野生型酶相比，进化的GkOYE3在脱饱和过程中的催化速率明显更快。
图 6. 机理研究
【总结】
本文利用此类酶的遗传多样性和定向进化的力量，成功地将 ERED 重新用于高效和对映选择性脱氢。该生物催化脱饱和平台代表了一项具有广泛合成用途的宝贵进步，能够在温和条件下使用空气作为终端氧化剂获得具有远程四级手性中心的多种环己酮。这种去对称化脱氢反应为未来开发生物催化脱饱和系统奠定了基础，其反应性和选择性是小分子催化剂无法比拟的。
来源：高分子科学前沿
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