中文摘要
狂犬病病毒引起的狂犬病是一种在人畜中广泛传播、可感染神经系统且具有致死性的传染病。狂犬病的临床症状主要包括恐水、流涎、狂躁或兴奋等，目前尚无有效治疗手段，发病后100%死亡，狂犬病疫苗仍然是预防和控制狂犬病最有效的策略。此文就中国狂犬病流行病学、狂犬病疫苗株及人用狂犬病疫苗研究进展进行综述，以期为优化狂犬病防控策略提供理论依据。
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正文
狂犬病是由狂犬病病毒感染引发的烈性传染病。患者在感染狂犬病病毒的潜伏期无任何症状，发病时患者出现焦虑、头疼、全身发热、感染部位刺痛等症状，而后出现神经兴奋、脉搏加快、流汗、流涎、吞咽困难，进而造成昏迷、麻痹，最终导致死亡。狂犬病的病程持续约1周，因患者神经病变导致神经兴奋阈值降低，在外界轻微刺激，如饮水时，引发肌肉痉挛。狂犬病潜伏期差异大，从数周到数年不等，一般为1~3个月，且儿童发病症状较成人重。狂犬病是最严峻的全球性公共卫生问题之一，目前全球每年约70 000人死于狂犬病。中国属于狂犬病流行地区，狂犬病在我国华南地区高发。目前针对狂犬病尚缺乏有效治疗手段，但通过暴露前或暴露后接种狂犬病疫苗，可以防治狂犬病。了解狂犬病流行情况和现代狂犬病疫苗技术的研究进展，可以更有效地建立狂犬病的防治策略，提高人类健康水平。
1
狂犬病流行病学
1.1
病原学特征
狂犬病病毒属于弹状病毒科，长约180 nm，直径约75 nm。狂犬病病毒由1个内部单元和1个外部单元连接形成。内部单元由核衣壳组成，包括磷蛋白（phosphoprotein，P）、核蛋白（nucleoprotein，N）和病毒聚合酶结合的基因组RNA。外部单元由病毒糖蛋白（glycoprotein，G）的突起和从宿主细胞膜获得的双层脂质包膜组成。内部单元与外部单元由基质蛋白（matrix protein，M）连接。狂犬病病毒具有神经嗜性，对温度敏感，病毒悬液在60 ℃ 30 min或100 ℃ 2 min的条件下即可被完全灭活，也易被日光、紫外线灭活。
1.2
传播途径、发病机制及易感人群
狂犬病可通过恒温动物进行传播，人类狂犬病的感染源包括犬、猫、狐狸和蝙蝠等。人类被携带狂犬病病毒的动物咬伤、抓伤或舔舐黏膜后，可能感染狂犬病病毒。
狂犬病病毒感染机体后，首先感染暴露处的神经细胞，再由神经组织移动至中枢神经，大量增殖并破坏神经系统，使神经系统信号紊乱，出现退行性病变。磷脂酶C、丝裂原活化蛋白激酶1/2、磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶C和酪氨酸激酶可能是狂犬病发病过程中的关键蛋白。狂犬病病毒的发病机制，如狂犬病病毒如何通过破坏细胞运动蛋白完成整个感染周期，还需进一步的研究。
研究表明，人群普遍对狂犬病病毒易感，15岁以下青少年与50岁以上人群发病率均较高，且男性发病人数高于女性。
2
国内常见的狂犬病疫苗株
我国常见的狂犬病疫苗株分别为aG株、CTN-1株、PV-2061株和PM株。狂犬病病毒aG株为北京株在豚鼠脑和原代地鼠肾细胞交替传代获得的地鼠肾适应株；3aG-V株是郑海发等使aG株适应Vero细胞，用豚鼠脑内含3aG-5株病毒的悬液感染Vero细胞后，经适应处理后得到的狂犬病疫苗株。与aG株相比，3aG-V株潜伏期更长，不会在动物脑内形成尼氏体，对动物的致病性也较弱。CTN-1株为1956年从山东淄博的1例死于狂犬病的患者脑组织中提取后经小鼠脑内连续传代，又经KMB-17细胞连续传50代获得的狂犬病疫苗株。PV-2061株是在法国巴斯德研究所分离的固定毒，是在兔脑内传2 061代后，再在Vero细胞上传代得到的Vero细胞适应株。PM株为1882年法国巴斯德研究所分离的固定毒，经兔脑传代保存并在多种细胞传代后获得。
2.1
常见狂犬病疫苗株与国内流行街毒株的相似性分析
aG株的G基因序列与街毒株的G基因序列相似性84%，与PV株、CTN-1株、3aG-V株的G基因序列相似性分别为92%、84%、99%。CTN-1株G基因和N基因的核苷酸序列与国内流行街毒株的核苷酸序列同源性分别为80.4%～94.3%和84.2%～95.0%。PV-2061株与国内流行街毒株的G基因序列同源性为81.91%～98.03%，其N基因序列同源性高于92.44%。PM株与国内流行街毒株同源性较低。我国狂犬病疫苗株与流行街毒株的基因测序结果表明，CTN-1株与我国流行街毒株的N基因序列以及与引起保护性免疫应答的主要抗原G基因序列的相似性均高于PM株、aG株和PV-2061株，CTN-1目前依然是我国生产狂犬病疫苗的备选疫苗株。
2.2
常见狂犬病疫苗株的传代适应性
aG株在不同的细胞株上传代适应性良好。aG株在鸡胚成纤维细胞上传代31代后，病毒滴度为7.17 lg半数致死剂量（median lethal dose，LD50）/ml。在人二倍体细胞上传代，第55代之前，aG株病毒滴度基本维持在7.0 lgLD50/ml以上，且免疫原性较高。在aG株进行狂犬病疫苗生产的传代适应性研究中，aG株在原代地鼠肾细胞上传代44代后，病毒滴度稳定在4.5 lgLD50/0.03 ml。aG株在地鼠肾细胞连续传代后，再经豚鼠脑、地鼠肾细胞交替传代3次获得的3aG-V株，在Vero细胞上进行多次适应传代后，其滴度可达8.3 lgLD50/ml。3aG-V株经多次传代后仍能保持弹状形态，豚鼠和家兔经过该毒株免疫后的血清抗体效价分别达到了2.1～2.4 国际单位（international unit，IU）/ml和4.3～4.5 IU/ml。将3aG-V株在Vero细胞不同传代次数的病毒收获液接种小白鼠脑内后，小白鼠发病潜伏期与狂犬病病毒固定毒株相比无显著变化。
CTN-1株在传代过程中适应性好、病毒滴度高。孙燕等为大规模制备无血清狂犬病疫苗，将CTN-1株在Vero细胞中培养，细胞生长状态良好，收获的平均病毒滴度为6.50 lg 荧光灶单位（fluorescene focus unit，FFU）/ml。而当CTN-1株在鸡胚细胞上传33～58代时，病毒滴度为7.0～7.5 lg FFU/ml，稳定性较好。在CTN-1株用于狂犬病疫苗生产的传代适应性研究中，CTN-1株经过人胚肺二倍体细胞Walvax-2传15～30代后，病毒滴度达7.0 lgLD50/ml。CTN-1株经原代地鼠肾细胞传代适应后，狂犬病病毒滴度为7.0 lgLD50/ml，将CTN-1株传代适应后用于制备疫苗，其效价为6.11～6.55 IU/ml。
PV株在BHK21细胞上传代时，感染后10 d收获的病毒滴度为4.23 lgLD50/0.03 ml，狂犬病病毒PV-2061株在MRC-5细胞上进行连续适应性传代，在10—13 d时，收获的病毒滴度均高于6.5 lgLD50/ml。在PV-2061株进行狂犬病疫苗生产的传代适应性研究中，辽宁成大生物股份有限公司用Vero细胞培养制备的PV-2061株疫苗，病毒平均滴度为7.6 lg LD50/ml。
在PM株进行狂犬病疫苗生产的传代适应性研究中，法国Merieux研究所将PM株在人二倍体细胞MRC-5上适应传代制成疫苗，商品名为Imovax®，对受试者间隔1个月注射2次，所有受试者均产生了抗体，受试者在注射疫苗后49 d产生的中和抗体几何平均滴度为12.90 IU/ml。
2.3
常见狂犬病疫苗株的免疫效果
aG株狂犬病疫苗的免疫效果研究显示，348名志愿者按3针法或5针法接种国内某厂家aG株狂犬病疫苗，期间不良反应较轻，未发生中、重度不良反应，接种3次的27名志愿者和接种5次的30名志愿者在14 d后，抗体阳转率为100%，抗体滴度也分别达到2.89 IU/ml和4.42 IU/ml；34名志愿者第5针次接种国内另一厂家的aG株狂犬病疫苗，期间未发生中、重度不良反应，14 d后抗体阳转率为100%，抗体滴度为3.1 IU/ml。长春生物制品研究所有限责任公司的aG株狂犬病疫苗临床试验中，完成3针接种的118名志愿者14 d后抗体阳转率均为100%，抗体几何平均浓度为9.68 IU/ml。
CTN-1株制备的狂犬病疫苗5针次接种33名受试者14 d后，其中和抗体阳转率均达100%，中和抗体水平为11.94 IU/ml。钱浩等的研究观察到了类似的现象，20名健康受试者接种CTN-1V株制备的狂犬病疫苗14 d后，不良反应率为35% ，中和抗体阳转率达100%，中和抗体水平为13.08 IU/ml。
在辽宁成大生物股份有限公司的PV-2061株疫苗成大速达®的临床试验中，按5针次接种疫苗的502名受试者，首次接种后第45天的抗体阳转率为100%，中和抗体几何平均滴度为9.5 IU/ml，未发生严重不良反应。282名暴露后志愿者采用“2-1-1”接种程序接种成大速达®，并经3年内2剂加强免疫，加强免疫14 d后的抗体阳性率均在99%以上。
蔡勇等报道了成都康华生物制品股份有限公司PM株疫苗HDCV®的保护效力。采用5针法接种的试验组在首次接种后第42天的抗体阳转率为100%，血清中和抗体几何平均滴度为37.575 0 IU/ml，接种疫苗后受试者的不良反应较轻，且不良反应均在72 h内消失。李幸乐等报道13例狂犬病暴露者采用5针法接种HDCV®15 d后，中和抗体水平在17.82 ~258.16 IU/ml范围内，随访半年无人发病。
aG株、CTN-1株、PV-2061株和PM株狂犬病疫苗在免疫效果研究中均可产生较高中和抗体滴度，保护效果较好，且不良反应较轻，均具有良好的安全性和免疫原性。
3
国内已上市人用狂犬病疫苗和研究现状
3.1
国内已上市人用狂犬病疫苗
人用狂犬病疫苗根据细胞培养基质可分为原代细胞培养疫苗和传代细胞培养疫苗。原代细胞没有致瘤风险，但其细胞种类复杂，难以保证细胞质量的一致性，且营养条件要求较高，不能进行生物反应器大规模化培养，外源致病微生物污染的风险较大。传代细胞质量可高度控制，细胞生长条件要求较低，可采用生物反应器大规模生产，大多数病毒可在该类细胞系中繁殖，但有一定的致瘤性，疫苗必须经过纯化，且细胞DNA含量必须达到标准。
我国目前批准上市且仍在使用的人用狂犬病疫苗均为细胞培养疫苗，培养基质分别为Vero细胞、原代地鼠肾细胞和人二倍体细胞（表1）。
疫苗的质量直接关系到国家公共卫生健康与安全，目前上市的狂犬病疫苗在预防狂犬病方面已取得一定的成功。2007年至2023年，我国狂犬病的年发病人数呈现下降趋势，从3 300例下降至131例。
3.2
国内狂犬病疫苗研发现状
人用狂犬病疫苗的发展，经历了以神经组织疫苗、禽胚组织疫苗、细胞培养疫苗、新型佐剂疫苗、基因工程疫苗等阶段。
神经组织疫苗中应用最为广泛的羊脑组织疫苗接种次数多，抗体产生应答慢、水平低，且体内有病毒残留的风险。禽胚组织疫苗存在不良反应率高、免疫保护率低等问题，其中，原代鸡胚细胞狂犬病疫苗由于生产成本较高，产量难提升，价格也相对较高，2019年起已无该疫苗的批签发。细胞培养疫苗是我国目前广泛应用的狂犬病疫苗，不良反应较少，能够安全有效地预防狂犬病。
新型佐剂狂犬病疫苗处于临床研究中。辽宁依生生物制药有限公司自主开发的皮卡佐剂狂犬病疫苗Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果显示，采用皮卡佐剂的狂犬病疫苗组中75.00％的受试者在第7天实现了血清阳转，而市售人用狂犬病疫苗对照组只有16.67%的受试者在第7天实现了血清阳转。
狂犬病基因工程疫苗作为1项新兴技术，能够降低成本且简化免疫接种程序。其中，人用狂犬病mRNA疫苗可以通过体液和细胞免疫达到高效的免疫应答，不需要与其他疫苗佐剂联合作用，且可能由其他物质引起的不良反应减少，成本低廉，可用于大规模生产。但狂犬病mRNA疫苗的1项临床试验发生了严重的不良反应，其安全性和有效性仍有待进一步研究。
4
总结与展望
目前我国常用的人用狂犬病疫苗株分别是CTN-1株、aG株、PV-2061株和PM株，均具有良好的安全性和免疫原性。国内的狂犬病疫苗均为灭活疫苗，多以原代地鼠肾细胞、纯化Vero细胞和人二倍体细胞为基质进行狂犬病疫苗的研制。随着研发技术的不断进步，部分新型人用狂犬病疫苗的研发已进入临床试验阶段，新型佐剂疫苗和mRNA疫苗是目前的研究热点。为了响应WHO在2030年彻底根除狂犬病的计划，需采取多方面的措施预防狂犬病的发生，最重要的方式之一是采用暴露前预防和暴露后接种彻底消除狂犬病。更加经济、安全、有效的人用狂犬病疫苗也将进一步被研发以用于保障人类健康。
作者
李美辰1 何成1 综述 周旭2 审校
1上海生物制品研究所有限责任公司第二研究室， 上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司， 上海 200051
通信作者：周旭，
Email：kathzhou@sina.com
引用本文：李美辰, 何成, 周旭.中国狂犬病疫苗研究进展[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 331-335.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231124-00020
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撰写| 国际生物制品学杂志
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
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