中国科学院生物物理研究所王祥喜研究员、饶子和院士团队以及中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员、陈瑜涛副研究员作为通讯作者于2024年11月在Nature Communications上发表了题为“Transcription regulation of African swine fever virus: dual role of M1249L”的研究论文。本研究解析了非洲猪瘟病毒RNA聚合酶（vRNAP）复合物结构，阐明了pM1249L在ASFV基因转录调控的分子开关功能。

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研究背景

非洲猪瘟病毒（ASFV）编码一种独特的不依赖于宿主的转录系统，该系统包括一个8亚基RNA聚合酶（vRNAP），临时表达的转录因子和转录相关蛋白，通过中间宿主促进跨物种传播。病毒粒子的蛋白质组成和病毒基因组中转录因子的存在表明在病毒感染过程中存在不同的转录系统。作者通过动态转录组分析、vRNAP相关组分分析和细胞实验的分析，强调了M1249L在病毒转录调控中的关键作用。vRNAP-M1249L超配合物的原子分辨率结构显示出多种构象，揭示了M1249L的双重功能。在转录早期，M1249L可以作为多个临时转录因子，其C端结构域作为激活/失活的开关，而在转录后期，它有助于转录机制的包装。M1249L的结构和功能特征强调了其在ASFV转录、包装和衣壳组装中的重要作用，为治疗干预提供了新的机会。

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研究结果

结果一：M1249L在ASFV vRNAP中起着关键作用

为了对内源性ASFV-vRNAP复合物进行亲和纯化，作者以ASFV减毒疫苗候选菌株HLJ/18-6GD19为基础，构建了在EP1242L基因上带有C端双链标签的重组ASFV-1242TS病毒（图1a）。使用Strep-tactin XT树脂纯化vRNAP复合物，通过SDS-PAGE分析、银染色和MALDI-TOF质谱分析，证实了8个vRNAP亚基的存在（图1b）。为了进行ASFV vRNAP的动态分析研究，作者从不同时间点（8/10/12/14/16/24 hpi）的PBM细胞中纯化vRNAP复合物。银染色表明M1249L与vRNAP亚基共纯化，在12/16/24 hpi时获得的纯化样品中比例增加（图1b）。

ASFV动态转录组的UMAP分析显示，病毒编码的转录因子NP868R（CE）、I243L（TFIIS）、C315R（TFIIB）和B263R（TBP）作为vRNAP亚基的早期转录基因聚集在一起，在8 hpi处达到峰值，而转录因子D1133L（VETFs）、G1340L （VETFl）、Q706L （NPH-I）、病毒粒子结构蛋白p17/p72/pp62/pp220和M1249L作为晚期转录基因在12 hpi处达到峰值而分组在单独的簇中（图1c, d）。考虑到纯化的ASFV颗粒中存在VETF、NPH-1和M1249L以及vRNAP亚基，并考虑到VETF和NPH-1参与了VACV vRNAP复合体的形成，作者推断M1249L也可能参与ASFV转录。质谱测定表明纯化后的ASFV vRNAP主要存在于两个峰中，分子量约为400 kDa和540 kDa。考虑到M1249L的分子量（144 kDa），这些峰分别对应于ASFV 8亚基核心RNAP和RNAP M1249L复合物（图1e）。此外，质谱测量表明，在8/10/12/14/16/24/48小时的样品中，vRNAP M1249L复合物的比例逐渐增加（图1f），与银染色分析结果一致（图1g）。

为了进一步研究M1249L的功能，作者采用了先前报道的荧光素酶报告系统，其中p72启动子下游的荧光素酶与其他转录因子一起被共转染的ASFV RNAP转录。作者发现M1249L与vRNAP共转染导致vRNAP活性显著的呈剂量依赖性增加（图1h），表明M1249L在ASFV转录中起着至关重要的作用。此外，将多种转录因子组合与vRNAP和M1249L共转染，结果表明，VETF的加入增强了vRNAP-M1249L复合物的转录活性，而NPH-I没有其他作用（图1i）。相反，在vRNAP中添加TBP-TFIIB-TFIIS-CE转录因子也增强了转录活性（图1i）。

图1. M1249L 在 ASFV vRNAP 的活性中起着至关重要的作用

结果二：ASFV核心vRNAP和vRNAP-M1249L复合物的结构测定

为了研究M1249L对vRNAP调控活性的影响，作者在48 hpi下纯化了ASFV-vRNAP复合物，并以2.6 Å（PDB: 8YQT）和2.7 Å（PDB: 8YQV）的分辨率获得了两种状态的vRNAP复合物的冷冻电镜重建。为了阐明M1249L的结构细节，作者使用了三轮3D分类，产生了三种不同的重建，分辨率分别为2.6 Å（PDB: 8YQW）、2.8 Å（PDB: 8YQU）和3.7 Å（PDB: 8YQY）。为了了解vRNAP与病毒转录因子之间的相互作用，作者分析了在不同时间点（12/16/24 hpi）分离的ASFV vRNAP复合物。通过对收集到的所有数据进行全面的统计三维分类方法，作者识别出25种不同的重构，突出了M1249L与vRNAP结合的各种状态（图S4）。

图S4. 动态ASFV vRNAP-M1249L复合物结构测定

结果三：ASFV vRNAP复合物的总体结构及其动力学

为了说明ASFV核心vRNAP的独特特征，作者将ASFV、VACV（PDB: 6RIC）、酵母（PDB:1WCM）和猪（PDB: 7EG7）的vRNAP进行了叠加。结果显示，ASFV vRNAP的结构更接近真核RNAP，而非其与VACV的NCLDV同源物（图2a）。此外，作者从12/16/ 24 hpi纯化的样品中鉴定出了约30%的vRNAP颗粒活性中心附近的内源性核酸。在vRPB1和vRPB2之间的间隙中，靠近桥状螺旋约10 Å处，观察到内源性核酸的额外密度（图2b）。因此，作者将一个8 bp的B型双链DNA片段（来自PDB:7EG723）建模到该区域。结果表明，该模型与周围带正电的氨基酸残基形成良好的静电相互作用，特别是来自vRPB1的R301、R305、K306、R311、K828和来自vRPB2的R229、R249、K267、R269、R410。作者没有检测到下游/上游双链DNA的密度，可能是由于双链DNA进入裂缝进行链分离的高迁移率。

在3D分类中，发现50%的vRNAP与M1249L结合，其单粒子构成达到3.0 Å的整体分辨率。基于该图谱进行建模，M1249L结构由6个结构域（D1-D6）组成，由非结构化连接体连接，并在vRNAP间隙的多个位点包裹vRNAP，形成一个大的埋表面积40,000 Å2（图2c-e）。使用DALI或VAST进行结构相似性搜索，没有发现任何结构域的同源结构，说明M1249L具有特殊的结构特征。vRPB1环通过含有三个Asp残基的NADFDGD （aa 455-461）基序配位一个Mg2+离子，形成催化中心。值得注意的是，在vRNAP颗粒中有一个区域的催化中心未被占用，允许模板DNA双链和mRNA的进入，表明处于活性状态（图2d）。相比之下，在vRNAP粒子的剩余区域中，M1249L的末端C尾环（残基1227-1249）占据了催化中心内的DNA结合位点，并与Mg2+离子相互作用。这种相互作用阻断了NTP通道，表明这些vRNAP粒子处于非活动状态（图2e）。

图2. ASFV核心vRNAP和vRNAP-M1249L复合物的结构

结果四：结构比较表明M1249L多结构域具有多种转录因子功能

为了阐明M1249L在转录中的作用，作者将ASFV vRNAP-M1249L复合物与猪RNAP和VACV vRNAP的结构进行了比较和建模。根据对结构域结构、结合位点和特定氨基酸基序的分析，作者推断M1249L的多结构域结构代表了转录因子类似物的组装，包括TFIID、TFIIB、TFIIS和TFIIF（图3-5）。

在转录起始阶段，RNA聚合酶II（RNAP II）与启动子的相互作用通常涉及与呈直线形态的双链DNA结合。D1中一组带正电的氨基酸，包括K95、K96、K97、R100、R102和K193，都朝向DNA主链，为起始前复合物（PIC）组装过程中与模板结合做准备（图3b）。通过与密切相关的哺乳动物PIC （PDB: 7EG7）的结构叠加，作者发现M1249L的D1位于DNA模板的上游，其环状结构与DNA凹槽配合良好（图3c,d）。动态图谱显示D1具有灵活性（图3e），允许其在DNA弯曲过程中移位。这种灵活性至关重要，因为与VACV共转录加帽复合物（CCC）的对比表明，D1的结合将与CCC内的甲基转移酶（MTase）结构域发生空间冲突（图3f）。因此，在CCC组装之前，DNA弯曲可能是诱导D1易位的必要条件，从而确保vRPB7的C端结构域（CTD）保持未结合状态。正如对重组ASFV vRNAP核心的分析所表明，这种构型将使vRPB7随后与NP868R的加帽酶（CE）结合，在vRPB7 C端MTase小亚基同源物形成CCC组装（图3f）。

图3. M1249L D1结构域的结构分析揭示了其作为一种类似于TFIID的瞬时转录因子的作用

TFIIB通过将Pol II招募到启动子，并通过其N端锌带结构域和C端B型核细胞周期蛋白折叠与DNA和TBP相互作用，在RNA转录起始中发挥核心作用。与人（PDB: 7EG7）、酵母（PDB: 4BBR）和VACV （PDB: 6RFL）的RNAP进行结构比较表明，M1249L的D2-D3-D4结构域与典型TFIIB的结合位置和结构相似（图4a, b）。D2包含一个类似于TFIIB的B-ribbon的锌指基序，随后是B-reader/linker环，探测vRPB1“停靠”和vRPB2“混合结合”结构域之间的接口。同时，D3和D4类似于真核RNAP中发现的B型核细胞周期蛋白折叠（图4c）。值得注意的是，D3位于RNA出口位点，必须移位以避免与正在延伸的RNA发生冲突。这与D3的低占位率（约1%）和动态图显示D2/D3/D4在各种组合中缺失（图4d）是一致的。这些结果表明，在病毒转录过程中，M1249L中的TFIIB样结构域会发生构象调整。在VACV中，B-core-C被一条非结构化链所取代（图4b,c），表明VACV在进化上距离更远。

图4. 通过结构分析，M1249L D2-D4结构域被鉴定为类似于TFIIB的临时转录因子

结构比较和序列分析表明，D5与人（PDB: 8A40）和酵母（PDB: 1Y1V）的RNAP中的TFIIS具有一定的相似性。与真核TFIIS类似，D5结合在漏斗的外缘（图5a），由类似于TFIIS结构域II的螺旋束和类似于TFIIS结构域III的锌带折叠组成（图5b, c）。此外，D5还包含一个酸性发夹结构，包含两个连续的酸性残基（D851和E852），这在TFIIS中是严格保守的（图5d），并对RNA延伸和切割至关重要。然而，D5的结合位点与典型真核生物TFIIS的结合位点并不完全一致，酸性发夹的位置/方向也不完全对齐，这表明D5可能处于未触发状态，仅在需要延伸或回溯时才准备进入漏斗。这一假设得到了动态图的支持，动态图显示酸性发夹密度相对较弱且具有弹性（图5e）。

图5. 对M1249L D5结构域的结构分析表明，它是一个与TFIIS相似的临时转录因子

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总结

本研究介绍了 ASFV 及其与 M1249L 复合物的内源性 vRNAP 的结构。作者的研究结果揭示了 M1249L 作为参与早期转录的病毒转录因子的多功能作用，不仅参与衣壳组装，还在vRNAP 构建和转录调控中发挥作用。这些结果突出了 ASFV 特异性结构特征，并为未来控制和治疗 ASFV 奠定基础。

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学习心得

本文深入研究了ASFV转录调控中M1249L的双重作用，通过原子分辨率的结构分析和功能研究揭示了M1249L的不同构象，展示其在ASFV转录调控中的关键作用，为理解ASFV的转录机制提供了新的视角。我们可以进一步深入研究M1249L的功能和作用机制，以制定针对ASFV的治疗干预措施。

本文作者：周慧

责任编辑：赵钦 孙亚妮

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39567541/

来源：ZhaoSunLab

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