长久以来，合成生物学研究聚焦在如何精准地控制生物的行为，让它们完成特定的任务 （比如生产重要的化学品、检测疾病标志物、靶向治疗肿瘤等） 。合成生物学家希望通过构建基因线路，像编写代码般编程生物系统的行为。在这种理念的驱动下，近年来多种多样的基因线路被构建出来，包括布尔逻辑线路、记忆线路、振荡线路等，使得活细胞能根据输入信号的强度、持续时间、组合等产生随时空变化的输出信号【1】。然而，目前基因线路的复杂程度和规模仍然比较有限，主要是由于两个难题：首先，用来搭建基因线路的“积木” （也就是基因元件） 比较缺乏【2】，而大规模的基因线路的构建对基因元件的质量和数量都有比较高的要求；其次，目前的基因线路设计策略需要消耗大量的基因元件 （尤其是转录因子） ，加重了细胞的代谢负担、降低了线路的响应速度【3】。因此，开发高质量的基因元件和简单高效的基因线路设计策略，对提高基因线路复杂度和规模至关重要。
近日，浙江大学王宝俊团队在Nature Chemical Biology上发表了题为“Programmable trans-splicing riboregulators for complex cellular logic computation”的研究文章 （高元力为第一作者） ，为上述两个重大问题提出了解决方案。该研究首先开发了一种基于断裂内含子反式剪接的新型基因调控技术SENTR，在RNA水平实现了可编程、可预测、模块化且正交的基因表达调控。随后，该研究提出了断裂内含子和内含肽结合的生物分子剪接复合线路设计方法，在活细菌中成功实现了可以处理多达6个输入信号的复杂逻辑计算。
图1 基于断裂内含子反式剪接的核糖调节子SENTR具有优越的可编程性、可预测性、正交性、灵活性，可用于RNA检测、RNA逻辑计算以及断裂生物分子的多输入复杂逻辑计算
首先，为了解决基因线路设计中高质量元件缺失的问题，研究团队着眼于RNA水平的基因表达调控，寻求新型调控元件。RNA水平的基因表达调控具有可编程性高、可预测性强、响应速度快、代谢负担小等优势，是开发正交基因元件的理想选择【2】。研究团队选择了第一类内含子 （Group I intron） 作为工程化改造的目标：它是具有自我催化活性的RNA分子，通过折叠成特定的RNA结构，在细菌中也可以介导RNA剪接反应。通过把内含子在茎环区域断裂，可以将前体RNA拆分成两条RNA链 （5’ RNA和3’ RNA） ，使其只有同时表达时才能组装成完整内含子，进行RNA反式剪接。
然而，第一类内含子在细菌中的反式剪接效率较低【4】，为此，研究团队设想能否通过设计互补配对的RNA结合域 （EGS） 作为“分子胶水”，来协助断裂内含子的组装，进而提高目的基因的反式剪接活性 。目的基因转录出的5’ RNA和3’ RNA在“分子胶水”EGS的协助下，才能正常的组装成完整的内含子，剪接产生完整的mRNA，从而成功表达出目的蛋白 。通过对EGS序列进行从头设计，研究团队建立了包含56条EGS序列的断裂内含子文库，具有极低的泄露水平和从10倍到大于1000倍连续变化的动态范围 。
基因元件的可预测性和正交性对于大规模基因线路的组装构建至关重要。可预测性是指根据基因元件的DNA序列，使用计算方法对它的活性进行预测的能力；正交性是指多个元件同时使用时，相互之间互不干扰的能力。研究团队通过对1296对EGS组合的反式剪接活性进行高通量表征，结合机器学习算法，实现了根据EGS序列对断裂内含子剪接活性的精准预测 。随后，研究团队系统性的探索了多种内含子组分的正交设计 （如正交EGS序列、内含子断裂位点、内含子种类等） ，构建了大规模的正交断裂内含子元件库 。
在获得高质量基因调控元件之后，研究团队尝试构建了基于断裂内含子的布尔逻辑计算线路。布尔逻辑计算线路可以根据不同的输入信号0和1的组合，产生0或1的输出信号。例如，布尔逻辑中的与门只有在两种输入信号都存在 （输入都为1） 的情况下，才能产生明显的输出信号 （输出为1） 。研究团队通过设计RNA相互作用，首先构建了六个双输入布尔逻辑计算线路，包括与门、与非门、蕴涵门、蕴涵非门、或门和或非门 。随后，通过在目标基因中插入多对断裂内含子，研究团队将转录激活因子ECF20和转录抑制因子LmrA的mRNA拆分成三段或四段，再利用多个反式剪接反应将其连接成完整的mRNA，成功构建了三输入与门和四输入与门 。
最后，为了解决当前基因线路设计中转录因子消耗过多的难题，研究团队提出了一种新型的基因线路设计策略：基于内含子和内含肽耦合的生物分子剪接线路设计策略。在这种设计框架中，断裂内含子负责催化RNA层面的分子剪接，而断裂内含肽催化蛋白层面的分子剪接，输入RNA分子经过RNA剪接并翻译成肽链，继而进行蛋白剪接形成具有功能的转录因子。使用这种策略对转录因子进行拆分，研究团队成功使用单个转录因子，构建了四输入与门、四输入与非门和六输入与门 。该六输入与门是目前最复杂的与门线路；相比之下，传统的级联转录因子策略需要十个转录因子才能实现相似的功能【3】，因此该方法可将单个转录因子的信息处理能力提升10倍。
总而言之，这项研究围绕目前基因线路规模化、复杂化面临的两个难题--高质量正交基因元件缺乏和转录因子消耗过多，开发了基于断裂内含子剪接的新型基因调控技术和元件，并提出了基于断裂生物分子剪接的复杂基因线路设计策略。研究中开发的内含子元件在RNA检测、RNA环化以及RNA疗法等领域有诸多潜在应用，而基于内含子和内含肽的基因线路设计策略可以大幅提高单个转录因子的信息处理能力和逻辑计算线路的复杂度，将为复杂基因线路设计提供新的范式。
https://doi.org/10.1038/s41589-024-01781-4
王宝俊，浙江大学求是讲席教授，现任浙江大学杭州科创中心生物与分子智造研究院副院长、合成生物学研究所所长。长期致力于合成生物学使能技术、基因线路设计研究及其在生物传感、智能诊疗和生物制造等领域的创新应用。近五年以通讯作者发表重要学术论文30余篇（包括Nature Chem Biol 等8篇Nature子刊论文）。课题组长期邀请对合成生物学使能技术、基因线路设计研究及创新应用感兴趣的学者（研究员、博士后、科研助理、研究生等）加盟团队或者探讨课题合作。感兴趣者可投递简历、拟申请岗位和工作设想。
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制版人：十一
参考文献
1. Gao, Y., Wang, L. & Wang, B. Customizing cellular signal processing by synthetic multi-level regulatory circuits.Nat. Commun. 14, 8415 (2023).
2. Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J. & Yin, P. Toehold Switches: de-novo-designed regulators of gene expression.Cell159, 925–939 (2014).
3. Moon, T. S., Lou, C., Tamsir, A., Stanton, B. C. & Voigt, C. A. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells.Nature491, 249–253 (2012).
4. Olson, K. E. & Muller, U. F. An in vivo selection method to optimize trans-splicing ribozymes.RNA18, 581–589 (2012).
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