盐析效应是指通过添加盐，使溶质从其水介质中分离的一种现象，这种低成本分离技术已有两个多世纪的工业应用历史。在水溶液中，溶质通过氢键或偶极-偶极相互作用与水结合形成水合物。当盐加入溶液后，盐会解离为水合离子，与溶质竞争性地争夺水分子，导致溶质脱水并与水分离。如果溶质是聚合物，这一过程通常会导致聚合物沉淀或形成凝胶，但在某些情况下会引发液-液相分离（LLPS），生成富含聚合物的液滴。目前，LLPS 产生的液滴或凝聚体因其多相结构特性，已被广泛研究与生命起源和原始细胞相关的背景。然而，LLPS 的潜力作为一种实用分离技术尚未被充分探索。
在此，东京大学相田卓三(Takuzo Aida)教授和Hao Gong博士报道了在固液界面处的特定液液相分离可以将几乎相同结构的DNA分配成同心圆。当将含有不同末端聚乙二醇（PEG）样品的硫酸铵水分散体滴铸到玻璃表面时，即使PEG部分的分子量相同，它们也会在固液界面竞争性扩散并形成微米级同心圆。这一现象是由玻璃表面自发形成的硫酸铵层引起的。基于这一机制，作者成功将几乎相同的DNA混合物分配成同心图案，并利用盐析效应从人类致癌单核苷酸变异的1:1混合物中分离出纯度高达97%的DNA，展示了这一方法在精准分离中的潜力。相关成果以“Near-identical macromolecules spontaneously partition into concentric circles”为题发表在《Nature》上，Hao Gong为一作兼通讯。
Hao Gong 和 相田卓三
值得一提的是，这是相田卓三教授课题组近半个月内的第二篇正刊！
PEG 通过 DLLPS 进行同心分割
在研究含硝基苯并恶二唑（NBD）的PEG盐析行为时，作者发现了一种独特的同心分配现象。在高浓度(NH₄)₂SO₄溶液中，PEG分子通过两次液-液相分离在固液界面形成微米级同心图案（图1a）。首先，PEG在溶液中形成初级液滴，随后液滴在玻璃表面因盐层诱发二次分离，生成富含不同PEG的环和核心（图1b）。优化工艺后，即使分子量高达500,000 Da的PEG也能实现这种分配模式（图1b(iii)）。更有趣的是，多种PEG混合物（如荧光标记和非标记PEG）也能被快速、高效地同心分配（图1b(i)–(vi)）。飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）进一步证实了荧光环和非荧光核心中PEG分子的存在。这一发现展示了DLLPS技术在快速分配结构相似分子中的潜力，为分离技术和材料设计提供了新方向。
图 1：将几乎相同的大分子划分成同心圆
同心分区结果
研究发现，MePEG5KNBD和MePEG5KRhB的混合物在不同比例下会形成独特的同心图案。当MePEG5KRhB比例增加时，核心逐渐扩大，最终在100% MePEG5KRhB时形成带有橙色荧光的实心圆（图2a）。同样，100% MePEG5KNBD条件下也会形成实心圆，说明这种同心图案是两相在固液界面竞争扩展的结果，而非单一组分的简单行为叠加（图1a，步骤2-2）。扩展动力学分析表明，外围的MePEG5KNBD扩展速度更快，而核心的MePEG5KRhB扩展较慢（图2b, 2c）。此外，在二次液-液相分离过程中，两种PEG在初级液滴中均匀分布，但在固液界面逐渐被分离到各自的富集相，形成清晰的层状结构（图1a, 下插图）。这一过程为复杂图案的形成提供了重要的机制理解。
研究发现，在将水性两相分散体滴铸到玻璃表面后，(NH₄)₂SO₄盐层会自发形成（图1a，步骤2-1）。通过石英晶体微天平（QCM-D）测试，我们验证了(NH₄)₂SO₄的吸附行为。实验显示，当流体从纯水切换为26.4 wt%的(NH₄)₂SO₄溶液时，吸附质量迅速增加并在300秒内达到稳定水平（图2d）。进一步分析表明，玻璃基板上的(NH₄)₂SO₄层非常薄，仅占总用量的0.0018%（图2d）。接下来，将包含MePEG5KOH的PEG液滴分散体流入含有(NH₄)₂SO₄的流动模块中，发现其沉积模式与盐溶液流动后的沉积行为一致（图2d）。相比之下，若没有(NH₄)₂SO₄，即使长时间流动PEG溶液，沉积量也仅略有增加（图2d）。这表明(NH₄)₂SO₄盐层的存在促进了PEG液滴的沉积、二次LLPS以及随后的竞争性扩散，从而形成独特的图案结构。
相行为对于配分至关重要
研究表明，富含PEG的相根据其与(NH₄)₂SO₄的亲和力竞争性扩散，决定了同心图案的形成顺序（图1a，底部插图）。双节曲线和联络线的分析结果显示，不同末端的PEG对(NH₄)₂SO₄的亲和力顺序为MePEG5KNBD > MePEG5KRhB > MePEG5KNH2（图2e，上图）。这一顺序在低浓度范围内的双节曲线中也得到了验证（图2e，下图）。根据表面润湿理论，亲和力越强的PEG会扩散得越多，形成外层的图案（图2e，下插图）。进一步研究不同分子量的PEG发现，其亲和力顺序为MePEG5KNBD > HPEG10KOH > MePEG20KNBD > HPEG35KOH（图2f）。MePEG5KNBD表现出最高的润湿性，而HPEG35KOH最低。同心图案的出现顺序（图2f，插图）与(NH₄)₂SO₄亲和力顺序完全一致。这些结果揭示了(NH₄)₂SO₄盐层通过调控PEG扩散行为驱动同心图案的形成机制。
图2：同心分区的机理研究
核酸呈同心分布
研究表明，即使是核酸也能通过同心分配进行选择性提取。当染料修饰的单链DNA和RNA（如FAM和TAM）在同心分配条件下处理时，它们会被清晰地分离（图1c）。此外，通过盐析效应，还可以从未标记的DNA混合物中选择性提取特定序列的DNA。例如，在1:1混合的人类癌症相关DNA-1和其单核苷酸突变体DNA-2的样本中，尽管CLSM无法直接观察其同心图案，但利用分配-提取过程，DNA-1可在提取物I中富集至72%，而DNA-2在提取物II中富集至63%（图3b）。通过重复提取过程，DNA-1的纯度可进一步提高到97%（图3b，左下），而DNA-2经过七次提取后纯度也达到了90%（图3b，右下）。相比之下，如果DNA-1和DNA-2未经过同心分配，随机沉积后提取时则无法实现选择性分离。类似的结果也适用于3'端含单核苷酸突变的DNA样本，证明该方法在不同核酸混合物中的适用性（图3a）。这些结果展示了同心分配结合盐析效应在核酸分离和选择性提取中的潜力。
图 3：通过盐析效应选择性提取同心分配的 DNA
杂交后可视化分区
研究表明，通过附加染料的短DNA标签进行后杂交，可以验证同心分配的DNA分布模式（图4a）。作者使用了与DNA-(1)和DNA-(2)互补的荧光标签Tag1和Tag2处理DLLPS沉积物。结果显示，Tag1使外围发光更亮（图4b，左），Tag2则使核心形成实心圆（图4b，右），表明核心富含DNA-(2)，外围富含DNA-(1)。进一步实验中，将FAM和TAM标记分别添加至DNA末端后，处理的混合DLLPS沉积物显示清晰的同心图案：核心为洋红色，外围为黄色（图4d）。此外，无论DNA是否标记，通过分配提取操作，都可以从DLLPS沉积物中分别提取到DNA-(1)和DNA-(2)（图4c）。这些结果证实了DLLPS同心分配的准确性和可重复性，为DNA分离提供了新思路。
图 4：杂交后观察同心分区的 DNA 混合物
小结
即使是最先进的分离技术，对于结构相似的大分子分离仍然充满挑战。然而，本文发现DLLPS诱导的同心分配为分离仅因单个核苷酸突变而不同的人类基因片段提供了一种新方法（图注）。DNA和RNA作为遗传信息的载体，这项技术不仅能检测突变体，还能高效分离，为生命科学的基础研究提供了新工具。由于DLLPS过程具备自动化潜力，这一突破有望通过微流体技术进一步优化，推动相关领域的发展。
来源：高分子科学前沿
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