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导读
肠道微生物群对免疫系统有重要作用。野山参中低极性人参皂苷（LWG）具有潜在的免疫调节作用。然而，LWG如何调节肠道微生物群以增强免疫力尚不清楚。为了探索肠道微生物和代谢产物之间介导LWG免疫调节作用的相互作用，本研究考察了LWG对脾细胞和环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制小鼠的影响。我们在体内进行了代谢组学和宏基因组学分析，以探索LWG调节肠道微生物群以增强免疫力的机制。体外数据表明，4μg/mL的LWG可增强脾细胞活性。此外，LWG能有效减轻免疫功能低下小鼠的症状，包括体重减轻和肠黏膜损伤。LWG缓解了肠道微生物群紊乱，恢复了色氨酸代谢产物（IA、IAA和IPA），并显著提高了芳烃受体（AhR）下游的JNK、ERK和p38MAPK蛋白水平。本研究表明，LWG通过重塑肠道微生物群、恢复肠道黏膜和促进肠道微生物群相关的色氨酸代谢来激活AhR/MAPK通路，从而提高免疫力。这项研究为LWG调节免疫功能的机制提供了新的见解。
论文ID
原名：Low-Medium Polarity Ginsenosides from Wild Ginseng Improves Immunity by Activating the AhR/MAPK Pathway through Tryptophan Metabolism Driven by Gut Microbiota
译名：野山参中低极性人参皂苷通过肠道菌群驱动色氨酸代谢激活AhR/MAPK通路提高免疫力
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：5.7
发表时间：2024.11
通讯作者：越皓&郑飞
通讯作者单位：长春中医药大学
实验设计
实验结果
1. LWG复杂性分析
我们使用UPLC-Q-Orbitrap-MS在负离子模式下检测LWG提取物的人参皂苷（图S1）。精确的分子量、二级碎片离子、HR-MS数据、标准品、保留时间和其他相关信息用于鉴定化合物的式和结构。我们鉴定出30种化合物，包括人参皂苷Rb1、Ro、CK、Rs3和RK1（表S2）。
2. 脾细胞LWG的初步评价
我们研究了LWG对脾细胞的影响。我们在不同浓度的LWG（2、4和8μg/mL）刺激后48小时观察到细胞生长（图1A）。与对照组相比，LWG和ConA显著提高了细胞存活率（P<0.001）。在8μg/mL时，LWG组脾细胞的存活率最高。为了更好地探索LWG对脾细胞的细胞生长作用，我们选择了8μg/mL的LWG并在随后的实验中进行了评估。
图1 LWG的初步评估。（A）细胞的生存能力。（B）TNF-α、IL-10和TGF-β的分泌。（C）分泌IL-17、IL-1β和IL-22。（D）细胞周期。（E）Th17/Treg细胞亚型。（F）AhR、CYP1A1、CYP1B1、p38 MAPK、JNK和ERK的mRNA表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与ConA相比，#P<0.05、##P<0.01和###P<0.001。
LWG处理的脾细胞中G0/G1期细胞的百分比急剧下降，但S期细胞的比例上升（P<0.05）（图1D）。Th17和Treg细胞的百分比也发生了变化，LWG组Th17细胞减少，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增加（图1E）。为了评估LWG的免疫增强作用，我们评估了它对细胞因子分泌的影响。与对照组相比，LWG组的IL-1β和TNF-α水平显著升高（P<0.01），而IL-17、IL-22和TGF-β水平降低（P<0.05）（图1B、C）。LWG组AhR、CYP1A1、CYP1B1、p38 MAPK、JNK和ERK的mRNA表达显著升高（图1F，G）。此外，LWG上调了脾细胞中AhR、p38 MAPK、JNK和ERK1/2的表达（P<0.01），与Con A一致。
3. 小鼠身体特征和器官指标的变化
我们通过使用小鼠的体重、行为、器官指数和身体属性来评估该模型。起初，每只老鼠都很健康。3天后，除空白组外，所有组均显示出明显的体重减轻，证实建模成功。给药后，所有组的体重都有所增加（图2A）。与正常组相比，CTX干预显著降低了胸腺（P<0.01）和脾脏指数（P<0.05）（图2B，C）。然而，在LMS、LWG-L、LWG-M和LWG-H处理后，体重和器官指数增加，表明它们对免疫抑制小鼠具有调节作用。
图2 CTX注射前和注射后3天，小鼠的状况发生了变化。（A）重量变化。（B）胸腺指数。（C）脾脏指数。（D）脾细胞活力。（E）CTX处理小鼠的代表性H&E染色胸腺和脾脏切片。（F）血清中TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。（G）血清中IL-17、IL-1β和IL-22的水平。（H）脾脏Th17和Treg细胞的比例。（I）关于小鼠结肠中AhR、p38 MAPK、JNK和ERK1/2蛋白表达的数据，n=3。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与CTX相比，#P<0.05、##P<0.01和###P<0.001。
H&E染色显示，CON组胸腺组织结构紧密，染色清晰，细胞数量均匀，正常。与CON组相比，CTX组胸腺切片中的细胞数量减少，间质狭窄，因为细胞出现水肿并显示炎性细胞浸润。与模型组相比，LMS、LWG-L、LWG-M和LWG-H组胸腺细胞增加并均匀染色。CON组的脾脏组织病理学显示出独特的结构，淋巴细胞密集，红白髓分布均匀，边界清晰。与CON组相比，CTX组的脾脏有模糊的红白髓边界，白髓的结构被破坏。CTX小鼠的脾脏组织显示出LWG组的保护作用（图2E）。
我们研究了LWG对脾细胞的体内免疫刺激作用。首先，结果证实了脾细胞中的LWG增殖。如图2D所示，与CON组相比，CTX、LWG-H、LWG-M和LWG-L组的脾细胞增殖受到影响，这显著提高了脾细胞增殖率（P<0.01）。我们在三组之间没有观察到显著差异。然后我们检查CTX和对照小鼠脾淋巴细胞中Th17和Treg细胞的比例（图2F）。与CON小鼠相比，CTX小鼠的Th17/Treg细胞升高。添加LWG后，Th17细胞比率随着给药剂量的增加而降低，而Treg细胞比率增加。LWG-M组显示出比LWG-H组更强的效果。
此外，我们使用商业试剂盒检测血清中细胞因子的水平。与对照组相比，血清TNF-α和IL-10水平显著降低（P<0.01）；血清IL-17、TGF-β和IL-22水平显著升高（P<0.05）；CTX组IL-1β无明显变化，如图2F、G所示。然而，与CTX组相比，LWG干预后，血清中IL-17、TGF-β和IL-22的水平显著降低（P<0.01），血清中TNF-α、IL-1β和IL-10的水平显著升高（P<0.01）。如图2I所示，与CON组相比，CTX组结肠组织中p38MAPK和JNK水平显著降低（P<0.05）。与CTX组相比，LWG-M组小鼠结肠组织中AhR、p38MAPK和JNK蛋白表达显著增加（P<0.01），而ERK1/2没有显著变化，LWG-H组小鼠结肠组织中AhR和JNK蛋白的表达显著增加（P<0.01）。
4. LWG对肠黏膜通透性的影响
CTX给药后，结肠指数与正常组相比显著降低（P<0.05）（图3A）。H&E染色显示CON组隐窝结构完整，腺体排列有序。相比之下，CTX严重破坏了结肠的组织形态结构，隐窝脱落。在LWG-L、LWG-M和LWG-H组中，这些变化得到了缓解，腺体有序，恢复了栅栏状结构，隐窝长度增加（图3C）。此外，LWG降低了LPS、D-LAC和DAO的血清水平（图3B）。
本研究使用IHC检查了小鼠结肠中紧密蛋白的定位和表达，包括Caludin1、Occludin和ZO-1（图3D）。阳性区域是棕色和浅棕色的。与对照组小鼠相比，CTX可显著降低小鼠结肠细胞间连接处的Claudin-1和ZO-1（P<0.01）。然而，在LWG-L、LWG-M和LWG-H处理后，LWG在Claudin-1、ZO-1和Occludin的阳性区域的保护作用都增加了。与CTX组相比，LWG-L、LWG-M和LWG-H组Caludin1、Occludin和ZO-1蛋白的平均光密度值较低。与CON组相比，CTX组的Occludin和ZO-1显著下调（P<0.01），而CTX组中Caludin1水平没有显著降低（P>0.05）（图3E）。给药后，LWG-L、LWG-M和LWG-H组增加了这些蛋白质，其作用强于LMS组。这些结果表明，LWG对CTX诱导的肠道损伤有积极影响。
图3 LWG对小鼠肠黏膜通透性的影响。（A）结肠指数。（B）LPS、D-LAC和DAO的分泌。（C）用CTX处理的小鼠结肠直肠的代表性切片用H&E染色。（D）CTX处理小鼠的代表性IHC染色结直肠切片。（E）Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表达。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与CTX相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001。
5. LWG中的粪便代谢组学修饰
5.1 基于粪便的非靶向代谢组学
OPLS-DA模型用于评估粪便样本数据，以显示LWG对小鼠的有益作用。图S2A、B显示了OPLS-DA模型的得分图，R2Y和Q2的统计值用于评估模型的适用性和可预测性。每组的样本点在PC1维度上可以完全分离，小鼠粪便代谢组学具有明显的特征。此外，根据200次置换检验的结果，OPLS-DA模型都没有过度拟合（图S2C，D）。结果表明，各组的样本点在PC1维度上可以完全分离，小鼠粪便代谢组学具有明显的特征。此外，在200个置换检验结果中，没有OPLS-DA模型表现出过拟合，表明肠道微生物群对免疫稳态至关重要，并通过其代谢产物控制宿主免疫系统。我们使用LC-MS进行粪便非靶向代谢组测序后（图4A），发现对照组和CTX小鼠之间有27种代谢物丰度不同。此外，我们对CTX和LWG组之间的差异表达途径进行了KEGG途径富集分析（图4B，C）。与CON组相比，CTX组显示四种代谢标志物的水平显著下调，22种化合物的水平显著上调（表S3和S4）。LWG给药后，中胆红素原、四氢皮质酮、吲哚和l-Trp的水平升高，三乙醇胺、次黄嘌呤和花生四烯酸等16种代谢标志物的水平下调。它参与主要的代谢途径，即苯丙氨酸、花生四烯酸、嘌呤、色氨酸、鞘脂、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。这表明LWG的免疫调节与体内不饱和脂肪酸和蛋白质的代谢变化密切相关。
图4 小鼠粪便的途径分析。（A）粪便的总离子色谱图（TIC）。（V）CON组与CTX组。（C）LWG-M组与CTX组比较。（D–I）LWG-M对粪便中色氨酸和色氨酸代谢物（KYN（D）、TRY（E）、IAA（F）、IA（G）、IPA（H）和吲哚（I））水平的影响（n=6）。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与CTX相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001。
5.2 粪便色氨酸靶向代谢组学
由于色氨酸代谢产生吲哚、IA、IAA、IPA和KYN，我们采用靶向代谢组学来定量粪便样本中的色氨酸及其代谢产物。与对照组相比，CTX小鼠的KYN和TRY水平显著降低，但LWG显著增加了吲哚、IAA、IPA、KYN和TRY水平（图4E-J）。这些发现表明，LWG显著增加了CTX小鼠肠道微生物群衍生的Trp代谢物。
6. LWG对肠道微生物的影响
6.1 用α和β分析肠道微生物多样性
为了确定肠道微生物群落在LWG中的作用，我们对粪便样本进行了宏基因组测序。upset图清楚地显示了多组样本中共享和独特的微生物数量。图5A显示了四个样本组中独特和共同的肠道细菌种类的数量。CTX动物的肠道微生物群α多样性显著降低，与对照组相比，Chao1指数值大幅降低（图5C）。在β多样性的PCoA分析中，对照组和CTX小鼠的样本明显不同，表明两组的微生物群组成存在显著差异（图5B，P<0.05）。
图5 LWG对CTX小鼠肠道微生物群结构功能的影响。（A）Upset。（B）β-多样性（Bray-Curtis相似性指数）。（C）Chao 1指数。（D）门水平上肠道微生物群落的相对丰度。（E）属水平上肠道微生物群落的相对丰度。（F）物种水平上肠道微生物群落的相对丰度。（G）KEGG代谢途径信息。（H）CAZy酶类的相对丰度统计。（I）eggNOG功能蛋白相对丰度统计。
6.2 肠道微生物群落的门水平分析
在门水平上，CTX动物中拟杆菌的相对丰度低于CON组（图5D）。另一方面，我们发现CTX组的厚壁菌门和变形杆菌水平较高（P<0.05）。LWG-M组厚壁菌门和变形杆菌的相对丰度显著低于CTX组（P<0.05），但拟杆菌门的相对丰度较高。
6.3. 肠道微生物的属水平分析
在属水平上，CTX组的普雷沃氏菌明显高于CON组（图5E），而拟杆菌、乳杆菌和阿克曼菌明显较低。虽然LWG-M组中拟杆菌、乳杆菌和阿克曼菌的相对丰度上升，但与CTX组相比，普雷沃氏菌的相对丰度显著降低（P<0.05）。
6.4 肠道微生物群落的种水平分析
在物种水平上（图5F），与CON组相比，模型组中的Bacteroides_stercorirosoris显著增加（P<0.05），Muribaculaceae_bacterium_Isolate-080_(Janvier)、Bacteroides_acidifaciens和Prevotella_sp._MGM2减少。与模型组相比，LWG-M和LMS组均显示出较高的Muribaculaceae_bacterium_Isolate-080_(Janvier)和Bacteroides_acidifaciens的相对丰度（P<0.05），其他有害细菌的相对丰度降低。Spearman的相关性分析用于评估肠道微生物群和免疫参数之间的关系。热图如图6所示。分析显示，色氨酸代谢产物与Erysipelatoclostridium和Lactobacillus呈正相关，与促炎因子呈负相关。
图6 Spearman肠道微生物群、免疫因子和微生物代谢产物之间的关系
7. 肠道微生物群的功能差异
我们通过LDA从KEGG II级生物代谢途径中选择了总共22条明显不同的功能途径（图5G）。CTX小鼠中最显著丰富的功能是其他次生代谢物的生物合成。CON小鼠中最显著丰富的功能是萜类和聚酮类的代谢。在LWG小鼠的情况下，显著丰富的功能是转运和分解代谢、辅因子和维生素的代谢、细胞生长和死亡以及翻译。在LMS小鼠的情况下，显著丰富的功能是碳水化合物代谢、信号转导、脂质代谢等。CAZy功能注释分析（图5H）显示，每组的粪便微生物组主要由碳水化合物结合模块（CBM）、糖基转移酶（GL）、多糖裂解酶（PL）和糖苷水解酶（GH）组成。CTX小鼠的功能显著增强的是CBM27、CH29、CBM12和PL 22，而LWG-M小鼠的功能明显增强的是GT48、GT106和GT71。eggNOG功能注释分析的结果显示（图5I），CTX小鼠的细胞壁/膜/包膜生物发生率高于CON小鼠。细胞骨架、RNA加工和修饰、染色质结构和动力学均高于其他三组。
免疫系统有助于抑制疾病，是身体抵御过敏、感染和外来抗原的第一道防线。尽管研究表明LWG是一种有效的抗炎和免疫抑制剂，但其机制尚不完全清楚，其对肠道微生物群的潜在影响尚未得到探索。我们的结果表明，LWG通过增强微生物相关的Trp代谢来激活AhR/MAPK通路，从而改善免疫功能。
肠道微生物群通过分解难以消化的化合物并提供必要的营养，对宿主代谢和免疫系统发育至关重要。CTX是一种常用于免疫抑制动物的免疫抑制剂。同时，据报道，CTX可导致小鼠体内致病菌数量增加，从而导致小鼠肠道微生物群落紊乱。在这项研究中，我们调查了每组小鼠的菌群信息和UPSET多样性，发现与CON组相比，CTX组的肠道菌群多样性显著降低，也存在显著差异，表明CTX会导致小鼠的菌系紊乱。经过LWG样本的干预，这种情况得到了逆转，初步表明LWG可以有效调节肠道微生物群落，促进其恢复正常水平。作为肠黏膜屏障的重要组成部分，肠道菌群对肠黏膜形态的维持和修复具有积极影响。由于有害菌的增加，CTX处理小鼠的隐窝结构严重受损。LWG显著改善了免疫功能低下小鼠的肠屏障完整性，并增加了紧密连接蛋白的表达。门水平的厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值用于评估肠道菌群平衡。模型组小鼠F/B比值升高，导致肠道菌群异常，LWG在一定程度上逆转了这一趋势。变形杆菌的细胞壁主要由LPS组成，当它们破裂时，会产生内毒素。在正常情况下，这一比例并不高。其中，变形杆菌已被报道为肠道微生态失衡的重要标志物，免疫抑制可导致变形杆菌相对丰度增加，这在糖尿病模型中也会失调，可能与炎症有关。我们的研究发现，模型小鼠肠道中的变形杆菌失调，LWG给药后，变形杆菌含量恢复正常。
根据属水平肠道菌群的差异，LWG给药组可以促进拟杆菌、乳杆菌和阿克曼菌相对丰度的增加。乳杆菌是一种有益的细菌，可以通过先天免疫和适应性免疫调节宿主免疫，与肠道健康密切相关。这一结论与实验结果一致。LWG可以减少有害细菌的数量，增加或恢复乳杆菌的数量，保护肠道黏膜屏障，通过刺激乳杆菌的生长抑制有害肠道细菌，从而降低炎症性疾病的风险。研究表明，阿克曼菌支持肠黏膜完整性并增强免疫力。为了进一步探索LWG对肠道微生物群的影响，我们研究了它对微生物群遗传和功能变化的影响。LWG后，eggNOG功能基因、KEGG代谢途径和CAZy碳水化合物酶基因均有不同程度的增加，这可能是由于LWG小鼠肠道微生物数量的增加造成的。LWG通过功能菌群调节宿主能量、碳水化合物、氨基酸和其他营养物质的代谢和运输，发挥免疫调节作用。此外，非靶向代谢组学结果表明，LWG增加了Trp相关代谢物的含量，因此，我们将Trp代谢途径作为后续的研究重点。
先前的研究表明，色氨酸可以被肠道微生物代谢为指数和指数衍生物，然后被肠道上皮细胞吸收。色氨酸不仅是一种肠道营养素，而且在肠道免疫耐受和维持肠道微生物群落之间的平衡中起着至关重要的作用。当CTX抑制肠道微生物群时，Trp代谢物（IA、IAA、吲哚和IPA）的水平降低。色氨酸代谢物充当调节肠道免疫的AhR配体。色氨酸被肠道微生物群代谢为吲哚及其衍生物。乳杆菌属、梭菌属、拟杆菌属和双歧杆菌属的细菌产生吲哚乳酸和IAA，而某些种类的拟杆菌和梭菌属产生吲哚、IPA和IA。LWG干预显著提高了免疫功能低下小鼠的色氨酸及其代谢产物（IA、IAA、IPA和吲哚）水平。我们推测，LWG调节Trp代谢物并介导其从肠道迁移，从而激活AhR并发挥免疫调节作用。
此外，AhR通过NF-κB和MAPK等途径调节炎症细胞因子的表达，尤其是IL-6、TNF-α和TGF-β。相关性分析发现，色氨酸代谢物水平与IL-22、IL-1β和IL-10呈负相关。我们的研究结果表明，LWG可能通过促进微生物色氨酸代谢物来减轻免疫功能低下小鼠的炎症。此外，LWG干预组没有剂量依赖性，高剂量组表现不佳。这可能是因为，作为一种中药，大剂量服用可能会导致“热”等不良反应，影响小鼠的吸收和利用。
基于这些结果，我们提出了LWG改善免疫功能的潜在机制。LWG恢复肠道微生物平衡，特别是增加阿克曼菌、拟杆菌和乳杆菌，并使微生物Trp代谢正常化，促进IAA和IA等衍生物，激活AhR以调节MAPK通路并影响Th17和Treg细胞数量。此外，肠道屏障的完整性通过肠道菌群的作用得以恢复（图7）。
图7 LWG通过乳杆菌和色氨酸代谢物激活AhR/MAPK信号通路来增强免疫力
结论
总之，我们的结果表明，LWG改善了微生物失衡，恢复了肠道屏障功能，并丰富了来自肠道的色氨酸代谢产物（吲哚、IAA、IPA、KYN和TRY）。补充LWG激活色氨酸代谢产物以调节AhR/MAPK，从而减少炎症和免疫反应。通过关注重要的代谢物或细菌，本工作提出了一种潜在的免疫抑制治疗方法，并揭示了LWG免疫调节作用的独特机制。然而，这项研究并没有完全阐明AhR/MAPK分子相互作用的机制；因此，在未来的研究中，我们将结合粪便细菌移植和基因敲除等实验，确定LWG是否通过增加色氨酸代谢和激活AhR/MAPK通路来发挥免疫调节作用，并进一步探索LWG改善肠道屏障功能的机制。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39545702/
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