好书推荐！《动物行为实验指南》电子版pdf，网盘发货
《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。 《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。
tau蛋白病变是包括额颞叶痴呆和阿尔茨海默病（AD）在内的几种神经退行性疾病的一个标志性特征。然而，由于很大程度上缺乏用于检验相关假设的tau蛋白病起始与进展的生理模型，tau蛋白致病的事件发生顺序以及具有毒性的tau蛋白形式仍不明确。
基于此，2024年12月24日日本和光市理化学研究所脑科学中心Takaomi C. Saido研究团队在 Nature neuroscience杂志发表了“In vivo hyperphosphorylation of tau is associated with synaptic loss and behavioral abnormalities in the absence of tau seeds”揭示了在没有tau蛋白种子的情况下，体内tau蛋白的过度磷酸化与突触丧失和行为异常相关。（使没有tau蛋白聚集的种子，tau蛋白的过度磷酸化也能引发突触丧失和行为异常的风暴。）
作者培育出了一系列在人源化MAPT基因中表达导致额颞叶痴呆突变的转基因小鼠，以研究tau蛋白病的最早阶段。MAPTInt10 + 3G > A和MAPTS305N;Int10 + 3G > A品系在海马和内嗅皮层中呈现大量过度磷酸化的tau蛋白，但并未形成具有种子活性的纤维状结构。过度磷酸化tau蛋白的积累伴随着神经突退化、有效突触的丧失以及行为异常的迹象。作者的研究结果表明，在没有纤维状高阶结构的情况下，神经元毒性也可能发生，并且tau蛋白过度磷酸化很可能参与了tau蛋白病最早的病因学事件，这些tau蛋白病表现出异构体比例失衡。
图一 MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3小鼠病理性tau蛋白分布图
在这两种突变品系中，识别磷酸化tau的抗体均显示出阳性免疫反应，但在MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠中信号最强。在MAPTS305N;Int10 + 3 KI小鼠6月龄时即可检测到免疫反应，到15月龄时免疫反应增强。不同小鼠品系间信号强度存在一定差异，但受影响的区域是一致的。两种品系中磷酸化 tau免疫反应呈弥散分布。除了弥散性染色外，一些神经元的胞体部分对磷酸化tau显示出相对较强的免疫反应。基于识别tau蛋白202位丝氨酸（Ser202）和205位苏氨酸（Thr205）磷酸化的AT8抗体对胞体染色的强度和密度生成热图。在内嗅皮层、下托、齿状回多形层以及海马CA3和CA2的锥体细胞层观察到最强的细胞体信号。
在MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3小鼠中，内嗅皮层和下托中AT8阳性tau的积累主要在核周，并分布于II-IV层。在MAPTS305N;Int10 + 3小鼠中，在颞叶联合皮层、嗅周皮层、躯体感觉皮层和梨状皮层也检测到强烈信号。在孤束核（NTS，延髓的一部分）和丘脑室旁核中也检测到核周磷酸化tau染色。在MAPTInt10 + 3 KI小鼠中观察到类似的模式，尽管强度较弱且分布较稀疏。为了进一步分析MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3 KI小鼠中tau的磷酸化状态，作者使用几种磷酸化tau抗体对脑裂解物的Tris可溶性部分进行免疫印迹。这两种品系中磷酸化tau水平均显著升高，而各品系间总tau水平相当。与MAPT KI小鼠相比，MAPTS305N;Int10 + 3 KI小鼠中tau蛋白富含脯氨酸结构域（氨基酸212、217、231、235和238，与AT180抗体染色结果一致）和C末端（氨基酸396和404，与PHF - 1抗体染色结果一致）的多个位点的磷酸化增加。
图二 MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠表现出记忆缺陷
为了评估MAPT基因敲入突变小鼠是否表现出行为异常，作者进行了一系列行为测试。Y迷宫测试结果显示，与野生型和MAPT基因敲入小鼠相比，15-16月龄的MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠的自发交替率显著降低（这是空间工作记忆缺陷的一个标志）。旷场实验结果表明，与野生型和MAPT基因敲入突变小鼠相比，MAPT基因敲入小鼠的自主活动显著增加。同时，与MAPT基因敲入小鼠相比，MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠在旷场中央区域停留的时间百分比显著降低，这表明MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠的焦虑水平升高。通过新物体位置（NOL）测试评估，与MAPT基因敲入小鼠相比，MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠对新位置的偏好也显著降低，这表明这些动物的长期空间记忆受损。在巴恩斯迷宫任务的探测测试中，与野生型和MAPT基因敲入小鼠相比，MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠在目标洞附近停留的时间显著减少。在习得训练期间，各基因型之间在行为塑造程度上未观察到差异。在上述行为测试或转棒测试中，未检测到MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠与对照小鼠之间在自主活动上有明显差异。
图三 MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠表现出持续性、去抑制行为及淡漠症状
为了进一步评估那些被认为能反映额颞叶痴呆伴tau蛋白病患者临床症状的行为表型，作者使用IntelliCage开展了一系列行为测试，IntelliCage是一种用于群居小鼠的自动化笼内监测系统，重点关注评估行为去抑制、淡漠、行为刻板/持续性行为（反复执行相同的行为或思维模式，即使这些行为已经不再有效或适当）以及竞争优势的参数，以此判断小鼠是否表现出FTD中的行为症状。在对IntelliCage中为期2周的基础活动分析中，与其他基因型小鼠相比，MAPTInt10 + 3基因敲入小鼠更频繁地光顾角落。在其他参数方面未观察到差异，包括饮水活动（即鼻触次数和舔舐次数）、角落间的偏好和移动模式以及鼻触孔使用情况，这表明各基因型小鼠未出现严重的行为问题。在自定进度行为序列学习和行为灵活性任务（SP-FLEX任务,评估啮齿类动物（如小鼠和大鼠）的认知灵活性、序列学习能力和执行功能的行为学测试。该任务旨在模拟复杂的日常任务，涉及多个步骤的学习和灵活调整行为的能力，以应对环境变化）中，要求小鼠学习在两个距离较远的奖励角落之间来回移动的序列。为改变它们的行为模式，奖励角落的位置会发生变化。在每个任务阶段，达到标准所需的试验次数（一种学习表现指标），在第1阶段和第2阶段中，所有基因型小鼠之间均无差异。然而，在第2阶段，与野生型、MAPT基因敲入和MAPTInt10 + 3基因敲入小鼠相比，MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠在奖励访问中的持续性鼻触次数显著增加，在第1阶段也有类似趋势。行为抑制任务用于评估小鼠控制冲动的能力。在该任务中，每次试验要求小鼠在一定时间（“延迟时间”）内不进行鼻触，以获取水奖励。在延迟时间内出现的鼻触被计为过早反应，这是冲动性的一个指标。
研究表明，延迟时间越长，过早反应率越高。共进行了三个阶段的测试，随着阶段推进，平均延迟时间逐渐增加。与野生型小鼠相比，MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠的过早反应百分比显著增加，特别是在平均延迟时间较长的第2和第3阶段。在第1阶段，MAPT基因敲入小鼠也出现了这种效应。这些结果表明，MAPT、MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠表现出行为去抑制，即“冲动、鲁莽行为”。使用糖精溶解水或普通水作为不同价值奖励的味觉偏好和基于努力程度的选择测试，旨在评估快感缺乏和/或淡漠样行为迹象。所有基因型小鼠普遍偏好糖精的甜味。然而，MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠表现出努力厌恶增加的迹象，在后续测试中，为获取少量糖精水需付出递增努力（重复鼻触），此时它们选择糖精水的比率显著下降。这些结果表明MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠存在淡漠行为迹象。最后，竞争优势测试用于评估在限制供水后，小鼠在竞争有限水奖励资源（即四个角落）时的社交行为。结果显示，在各阶段（天数）中，各基因型小鼠在竞争优势方面无显著差异，不过MAPTS305N;Int10 + 3基因敲入小鼠的优势指数相对降低，优势指数指测试竞争时间段（前5分钟和10分钟）内的角落访问时长。
总结
研究借助表达人源化MAPT基因突变的转基因小鼠，探究tau蛋白病早期阶段。利用碱基编辑器创建多种突变小鼠品系，聚焦突变小鼠MAPTInt10 + 3和MAPTS305N;Int10 + 3）。免疫组化、免疫印迹及质谱分析显示，这两种突变小鼠中tau蛋白过度磷酸化，积累于特定脑区。行为学测试表明，MAPTS305N;Int10 + 3小鼠出现记忆缺陷、焦虑增加，还有持续性、去抑制行为及淡漠症状等行为异常。该研究证明突触丧失和行为异常可以在没有种子能力的高级结构（如tau蛋白聚集物）的情况下独立发生。这些高级结构并非启动毒性病理机制所必需。这项研究的价值不仅在于识别了疾病病理发生的最早事件，还在于提供了生理相关的tau病小鼠模型，这些模型将有助于理解如何预防神经退行性病变，并为开发治疗策略提供支持。
文章来源
https://doi.org/10.1038/s41593-024-01829-7
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