约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组，一篇Nat. Catal.一篇JACS！|伊红|催化剂|化合物|化学|活性|约翰霍普金斯大学|苯乙烯|课题组|黄雄怡

导读

近日，约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组在Nat. Catal.上发表光/金属酶协同催化构建手性C‒N3、C‒SCN键研究进展；在 J. Am. Chem. Soc.上发表新型酶催化三氟甲基化反应-金属酶催化烯烃三氟甲基双官能团化研究进展。

Nat. Catal.：光/金属酶协同催化构建手性C‒N3、C‒SCN键

光酶催化作为化学催化与生物催化交叉融合的前沿研究方向，在过去十年间取得了令人瞩目的进展。特别是依赖有机辅因子的酶，如含黄素辅因子（FAD/FMN）、磷酸吡哆醛辅因子（PLP）、烟酰胺辅因子（NAD(P)H）以及硫胺素辅因子（ThDP）的酶，在过去五年内几乎主导了光酶催化领域的所有突破性成果。这些催化体系成功将许多此前未曾在酶催化中实现的化学转化过程引入其中，为生物催化研究带来了全新的可能性。然而，光/金属协同催化这一重要的光催化反应模式在生物催化领域的发展却显著滞后。这与其在合成化学中作为主导催化策略的核心地位形成了鲜明对比。这种对比不仅揭示了当前生物催化领域的局限性，也表明这一方向蕴含着巨大的研究潜力。在此背景下，将光/金属协同催化的核心原理与生物催化相结合，能够为光酶催化的研究与应用开辟全新的可能性。这种融合策略可以利用光催化剂高效生成活性自由基物种，同时借助金属酶对化学选择性和立体选择性的精准调控，构建高效且高度可调的催化体系。通过这一跨学科的创新探索，光酶催化有望进一步拓展其在生物化学与合成科学中的应用边界。

图1

约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组致力于探索合成化学与合成生物学的跨学科融合，尤其在非血红素铁酶的功能化改造领域取得了重要突破。课题组的研究旨在通过创新策略，将化学催化的多样性与生物催化的高选择性结合，推动新型催化体系的发展。课题组主要聚焦于非天然化学反应在金属酶催化体系中的引入。通过定向进化手段，他们成功重塑了非血红素铁酶的催化机制，使其能够催化一系列天然酶无法完成的反应，从而显著拓展了金属酶的催化功能（Science2022, 376, 869-874 和Nature Synthesis2024, 3, 958-966）。这些工作展示了金属酶在催化科学中的巨大潜力。基于这一研究基础，黄雄怡课题组近期进一步创新，设计并实现了一种结合光催化与金属酶催化的新型光/金属酶协同催化体系（图 1）。这一体系成功将不对称金属光氧化还原催化的核心理念引入到酶催化中，开辟了生物催化研究的新方向。通过这一研究，课题组首次证明了光催化剂与非血红素铁酶在催化中的协同潜力。这种光/金属酶协同催化体系不仅能够实现高度对映选择性的自由基转化，还为未来开发更加复杂、多样化的催化反应提供了实践框架。

本研究探索了绿光照射下光催化剂伊红 Y (Eosin Y) 与 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶 (HPPD) 的协同作用，成功实现了氧化还原活性酯的对映选择性脱羧叠氮化和硫氰酸化反应。在研究的起始阶段，作者将野生型 HPPD 与光催化剂伊红 Y 结合，测试其对模型氧化还原活性酯 1-NHPI 的催化效果。结果显示，该体系能够以 21% 的收率、TTN = 140 和 er = 70:30 转化生成目标产物。为了提高催化效率与对映选择性，研究者对靠近底物结合区域和活性位点的 7 个氨基酸残基进行了定点饱和突变 (SSM) 筛选（图2）。筛选结果表明，SavHPPD V189A 突变体显著增强了催化性能，将 TTN 提高至 240，并将对映选择性优化至 er = 73:27。这一改进可能与活性位点空间结构的调整有关，从而提升了底物结合效率和自由基捕获能力。基于 SavHPPD V189A，进一步的突变筛选发现 S230Y 突变对提升对映选择性至关重要。研究推测，S230Y 突变通过在活性位点内创造更疏水的微环境，借助疏水相互作用或 π-π 相互作用，引导底物自由基更靠近 Fe(III)-N₃ 中间体，从而显著促进了 C‒N₃ 键的高效形成。优化后，目标产物的对映选择性 (ee%) 提升至初始值的两倍。在此基础上，通过进一步的 SSM 筛选，研究者最终构建了四重突变体 SavHPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A（简称 SavHPPD-PC）。这一突变体展现了卓越的催化性能，能够以 TTN = 200 和 er = 94:6 的高选择性生成目标产物。

图2

图3

在确定了最佳反应条件与最优突变体后，研究者系统地评估了光生物催化反应的底物耐受性（图 3）。结果显示，苯环上带有卤素、甲基和甲氧基取代基的底物表现出良好的耐受性，能够较高效地进行脱羧叠氮化反应。然而，含有异丙基和三氟甲基取代基的底物则未发生反应，这可能是由于这些较大的取代基与活性位点中的氨基酸残基之间产生了显著的立体位阻。此外，带有邻位氰基的底物同样无法反应，表明取代基的电子效应对反应过程也具有显著影响。对于一级、二级和三级烷基酸的 NHPI 酯，尽管反应的脱羧速率较慢，以及所生成的 C(sp³) 自由基的稳定性明显低于苄基自由基，这些底物依然能够被有效地转化为叠氮化产物。当叠氮被替换为胺、醇、卤素或拟卤素等其他亲核官能团时，反应未能进行。这种选择性可能是由于这些官能团无法与 SavHPPD 的铁中心有效结合，导致自由基捕获中间体无法成功生成。然而，当叠氮化物被替换为硫氰酸盐时，该体系能够以 TTN = 45~114 和 er = 56:44 ~ 78:22 生成对应的脱羧硫氰化产物。尽管产物的对映选择性尚不理想，但这标志着生物催化自由基 C(sp³)‒SCN 键形成的首次成功，凸显了光生物催化策略在开发新型金属酶自由基反应中的广阔潜力。

图4

作者与卡内基梅隆大学郭以嵩课题组及西班牙赫罗纳大学 Marc Garcia-Borràs 课题组合作，深入探讨了反应机理。研究发现，随着产物生成，底物始终保持为消旋体，表明酶能够同时结合 (

)- 和 (

1-NHPI，并有效催化其转化为自由基中间体（图 4a）。这一结论通过分子动力学模拟 (MD) 得到了验证。电子顺磁共振 (EPR) 实验进一步确认了 Fe(III) 中间体的形成（图 4b）。在无1-NHPI时，光照下 Fe(III) 的生成极少，而加入1-NHPI后，Fe(III) 积累显著增加。推测其原因可能是：(1) 初始单电子转移 (SET) 发生于1-NHPI和激发态伊红 Y 之间；或 (2) Fe(II) 与激发态伊红 Y 发生 SET 后，缺乏1-NHPI时发生快速反向电子转移，淬灭了还原态伊红 Y，从而限制 Fe(III) 的生成。斯特恩-沃尔默猝灭实验（图 4c）进一步揭示了 SET 过程。实验表明，1-NHPI单独存在时不会猝灭伊红 Y，而 Fe(II) 的猝灭效率也较低。然而，在酶存在下，猝灭效率提升了 4 倍以上，表明酶通过缩短伊红 Y 和铁中心的距离促进了 SET。分子动力学模拟与分子对接分析显示，伊红 Y 可能结合于

HPPD-PC 的多个位点，这些位点富含赖氨酸和精氨酸残基，并位于铁中心 20 Å 以内（图 4d）。这种结合模式与伊红 Y 借助极性表面残基与蛋白质结合的特性一致，支持了铁中心与伊红 Y 间长程电子转移的可能性。综合实验与理论分析，研究结果更支持图5中的催化循环 2 模式：激发态伊红 Y 首先将 Fe(II) 氧化为 Fe(III)，随后通过第二次 SET 激活 NHPI 酯完成反应。尽管无法完全排除催化循环 1 的可能性，但催化循环 2 的机理更符合实验观察。

图5

本研究构建了一个实现光/金属酶协同催化的实验框架，开拓了金属酶催化领域的新方向。未来，该方法有望通过进一步优化和推广，用于开发更多复杂的化学转化和生物催化反应。通过深入探索合成化学中多样化的光驱动自由基生成策略与金属酶催化体系的紧密结合，该生物催化平台有潜力发展出更加高效且多功能的光/酶协同催化方法。这一创新策略有望在生物催化领域得到广泛应用，为药物开发和绿色化学等领域带来突破性进展。

文章链接：Rui, J., Mu, X., Soler, J. et al. Merging photoredox with metalloenzymatic catalysis for enantioselective decarboxylative C(sp3)‒N3 and C(sp3)‒SCN bond formation. Nat Catal7, 1394–1403 (2024). https://doi.org/10.1038/s41929-024-01257-7

JACS：新型酶催化三氟甲基化反应-金属酶催化烯烃三氟甲基双官能团化

含氟化合物在医药、农药和化工领域占据重要地位。据统计，超过20%的药物分子至少包含一个氟原子，其中三氟甲基（CF₃）因其独特的物理化学性质和广泛的药物应用尤为突出。过去几十年，有机氟化学取得了长足进展，为三氟甲基的引入提供了多种合成策略。这些方法大大促进了含三氟甲基化合物的设计和制造。然而，与化学催化的快速发展相比，生物催化在氟化学领域（尤其是三氟甲基化学）的研究进展明显滞后，无论是在反应范围还是机理多样性上均有较大差距。近年来，一些关于酶催化引入氟烷基的研究逐步涌现（图1a– 1b）。尽管这些研究展示了酶催化引入氟烷基的潜力，但大多集中于非三氟甲基的氟烷基基团构建。而通过酶催化直接构建C(sp³)-CF₃键仍是一个未解决的核心难题。解决这一问题将为含氟化合物的生物催化合成提供全新路径，同时极大扩展酶催化在有机氟化学中的应用潜力。

图1

约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组近期开发了一种创新的金属酶催化体系，将金属羟化酶改造为能够催化对映选择性烯烃三氟甲基叠氮化反应的酶（图1c）。这一研究首次在生物催化中实现了高价碘试剂（如Togni试剂II）的还原活化，生成三氟甲基自由基，并引入复杂的双功能化反应。该工作不仅拓展了金属酶催化的化学反应范围，还为含三氟甲基化合物的酶催化合成提供了全新策略。研究的关键在于将化学中常见的高价碘自由基生成模式引入生物催化，通过酶工程优化，首次建立了直接构建C(sp³)-CF₃键的酶催化体系并创建了一个基于高价碘试剂的自由基催化平台，为开发更广泛的生物催化自由基反应打下了基础。该反应的设计基于以下机理设想：非血红素铁酶的还原态活性中心Fe(II)能够与Togni试剂II发生单电子转移反应，生成三氟甲基自由基。随后，CF₃自由基与烯烃底物3发生自由基加成反应，形成自由基中间体4。接下来，自由基中间体4被 Fe(III)-N₃中间体捕获，从而生成具有手性选择性的烯烃三氟甲基叠氮化产物（图1d）。

图2

作者以苯乙烯（3a）为初始底物筛选多种野生型非血红素铁酶，发现羟基扁桃酸合酶（

HMS）活性最高，生成三氟甲基叠氮产物5a的产率为4%。进一步测试取代苯乙烯后，选择4-甲氧基苯乙烯（3b）作为新模型底物，并从现有

HMS突变体库中筛选出六重突变体

HMS-QGHLYV，其产率提高至14%，对映选择性为69:31 e.r.。优化反应条件后，利用细胞裂解液使产率提升至31%。为进一步提升性能，作者利用定向进化策略，并开发了基于Staudinger连接反应的高通量筛选（HTS）平台。该系统通过荧光素探针快速定量检测叠氮化物生成，即使在高浓度NaN₃下也能精准分析（图2a）。通过HTS平台，作者对

HMS-QGHLYV（记为“P”）进行饱和突变筛选，获得七重突变体

HMS-V6（S201V、N334S、E190D、L338A、Y339V、S332G、G328S），对映选择性提高至91:9 e.r.，催化活性略有增强。随后，作者通过随机突变进一步优化，筛选出三重突变体

HMS-V7（P173L、D228N、A269T），对映选择性达92:8 e.r.。值得注意的是，这些突变位点均位于溶剂暴露区域且远离活性中心。在此基础上，新增三个定点突变（V342A、Q226P、L303M），最终获得优化突变体AoHMS-CF3，包含19个突变，生成5b的产率提升至53%，对映选择性为95:5 e.r.。通过降低底物浓度，产率进一步提高至67%（图2b-d）。

图 3

作者评估了最优突变体的底物适应性（图3a）。富电子型烯烃较缺电子型烯烃表现出更高的活性，反应对烷氧基、硝基和卤素等官能团具有良好耐受性，并对二取代苯乙烯表现出较广兼容性，产物收率为25%-64%，对映选择性为62:38至96:4 e.r.。杂芳烃类底物（如乙烯基吡啶）也兼容，收率为35%-80%，对映选择性为61:39至85:15 e.r.。此外，该反应可扩展至未活化烯烃，如4-烯丙氧基苯甲醚，以28%收率和79:21 e.r.生成目标产物。反应在制备规模上表现良好。在0.5 mmol规模下，产率达67%，对映选择性为95:5 e.r.（图3b）。产物中的叠氮基为衍生化提供了多样可能性，例如，通过CuAAC点击反应，将5b转化为三唑化合物6b，分离产率为55%，对映选择性保持在95:5 e.r.。该体系还展现出模块化潜力，其高价碘(III)活化机制可应用于多种自由基反应（图3c）。替换Togni试剂1a为五氟乙基碘(III)试剂，可生成五氟乙基叠氮化产物7b（产率21%，对映选择性90:10 e.r.）；使用叠氮苯碘唑酮（Zhdankin试剂）可生成双叠氮化产物8b（产率12%，对映选择性67:33 e.r.）。这些结果展示了该酶催化体系的广泛底物适应性和优异对映选择性，并证明其在自由基化学和复杂分子合成中的巨大应用潜力。

图 4

此外，作者尝试将叠氮替换为其他官能团，如醋酸根、卤素和拟卤素。然而，除了硫氰酸盐，其余试剂均未能发生反应。为探究这一现象，作者与卡内基梅隆大学郭以嵩课题组合作，利用光谱手段深入研究了反应体系的机理（图4）。研究发现，仅当硫氰酸盐或叠氮盐加入到

HMS纯化蛋白溶液中时，会引起显著的穆斯堡尔光谱变化。这表明，这两种阴离子能够与铁中心进行有效配位。而其他阴离子未能引发类似变化，说明它们无法与铁中心形成稳定的金属络合物。这一结果与课题组此前研究的结论相一致（Science2022, 376, 869-874），即官能团能否进行自由基转移，主要取决于其是否能够与铁中心有效配位。这一研究进一步阐明了铁中心配位对反应选择性的关键作用，并为设计更广泛的自由基转移反应提供了重要的指导。

本研究开发了一种创新的金属酶催化体系，实现了三氟甲基自由基的生成，并通过非血红素铁酶催化实现了不对称烯烃三氟甲基叠氮化反应。该体系引入全新双功能化活化模式，通过选择不同的高价碘(III)试剂，可扩展至五氟乙基叠氮化和双叠氮化反应，展现了广泛的适用性。这项研究为酶催化三氟甲基化提供了新工具，同时拓展了有机氟化学的研究空间。未来，该体系有望推动酶催化在复杂分子功能化中的应用，为合成化学和药物开发提供新的可能性。

文章链接：James G. Zhang, Anthony J. Huls, Philip M. Palacios, Yisong Guo, and Xiongyi Huang. Biocatalytic Generation of Trifluoromethyl Radicals by Nonheme Iron Enzymes for Enantioselective Alkene Difunctionalization. J. Am. Chem. Soc.2024, https://doi.org/10.1021/jacs.4c14310

（江南大学赵群供稿）