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导读

对乙酰氨基酚（APAP）已成为许多国家急性肝衰竭（ALF）的主要诱因。泽泻是一种常用的传统草药，含有大量的保肝活性小分子成分。然而，泽泻多糖（ARP）在肝脏保护中的具体作用尚不清楚。ARP50和ARP70是通过分级醇沉淀和纯化得到的，主要由不同比例的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。自由基清除的体外实验表明，ARP50和ARP70具有显著的抗氧化能力。为了研究肝保护作用，本研究在小鼠中建立了APAP诱导的急性肝损伤（ALI）模型。ARP50和ARP70对APAP诱导的肝损伤具有剂量依赖性的治疗作用。对肝脏代谢物的进一步分析表明，ARPs通过调节以l-谷氨酰胺为中心的代谢网络，促进了肝脏抗氧化系统的重建。此外，在ARPs的影响下，肠道微生物群的丰度发生了变化。ARP50显著降低了Pseudarthrobacter的水平，显著提高了Faecalibacterium的水平。同时，ARP50可以提高肝脏和血清中的乙酸水平。同时，ARP70显著增加了Dubosiella、Muribaculum、Ileibacterium和Prevotelaceae UCG 001的丰度，同时降低了Escherichia Shigella和Pseudarthrobacter的丰度。结果表明，ARPs可以通过重塑肝脏代谢特征和调节肠道微生物群来对APAP诱导的急性肝损伤发挥保护作用。

论文ID

原名：Alisma plantago-aquatica polysaccharides ameliorate acetaminophen-induced acute liver injury by regulating hepatic metabolic profiles and modulating gut microbiota

译名：泽泻多糖通过调节肝脏代谢谱和肠道菌群改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：7.7

发表时间：2024.12

通讯作者：姜苗苗

通讯作者单位：天津中医药大学

实验设计

实验结果

1. ARPs的物理化学成分

葡萄糖标准曲线如图1A所示，ARP50和ARP70中的碳水化合物含量分别为（54.68±2.99）%和（57.03±2.50）%。根据紫外光谱（图1B），ARP50和ARP70水溶液在260nm和280nm附近没有明显的吸收峰，表明ARP50、ARP70不含蛋白质和核酸。

图1 ARP的特征。（A）葡萄糖的标准曲线。（B）ARP50和ARP70的紫外光谱。（C）ARP50和ARP70的FT-IR光谱。（D）ARP50和ARP70的单糖组成分析。

ARP50和ARP70的FT-IR光谱（图1C）揭示了多糖的典型特征吸收带。很明显，ARP50和ARP70表现出相似的吸收光谱。多糖分子内的O-H伸缩振动在3330cm-1处表现为宽而强的吸收峰。此外，我们在2920 cm-1处观察到由C-H伸缩振动引起的吸收峰。1670 cm-1带与结合水有关。1000-1200cm-1范围内的吸收带可归因于C-O-H和C-O-C的伸缩振动。此外，与ARP70相比，ARP50在850 cm-1处显示出更强的α-糖苷键信号。

我们使用UHPLC-DAD分析ARP50和ARP70单糖组成。结果如图1D所示。与既定标准的比较分析显示，ARP50和ARP70中都存在葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。此外，ARP70显示出微量的甘露糖和木糖。在ARP50中，单糖组成比确定为葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=51.06:3.25:1.00，而在ARP70中，我们发现单糖组成比为甘露糖：木糖：葡萄糖：半乳糖苷：阿拉伯糖=1.02:1.00:4.46:35.78:13.07。

淀粉是植物根茎中多糖的重要组成部分。为了进一步阐明ARPs的组成，我们对ARP50和ARP70（补充材料）中的淀粉含量进行了评估。我们的研究结果显示，ARP50含有（6.07±0.60）%的支链淀粉，而ARP70中没有检测到淀粉。

2. ARPs的体外抗氧化活性

ARPs对DPPH自由基的清除能力如图2A所示。ARP50和ARP70对DPPH自由基表现出很强的清除能力，这种清除能力随着浓度的增加而增加，尽管与维生素C相比较弱。ARP50的半数效应浓度（EC50）为0.90mg/mL，而ARP70的EC50为0.39mg/mL，表明ARP70在体外清除DPPH自由基的能力优于ARP50。

图2 ARPs体外抗氧化能力的测定。（A）ARP50和ARP70的DPPH、（B）ABTS、（C）羟基和（D）超氧阴离子自由基清除活性。

如图2B所示，随着多糖浓度的增加，ARP70的ABTS清除活性在10mg/mL时达到峰值，而ARP50在40mg/mL时达到最大值。ARP70和ARP50的EC50分别为2.02 mg/mL和10.74 mg/mL，表明ARP70的ABTS自由基清除能力优于ARP50。

如图2C所示，随着药物浓度的增加，ARP50和ARP70对羟基自由基的清除能力显著增强。当多糖浓度低于4mg/mL时，ARP50和ARP70之间的羟基自由基清除能力差异很小。随后，随着浓度的升高，ARP50的清除率高于ARP70。此外，ARP50的EC50为7.50 mg/mL，而ARP70为12.25 mg/mL。ARP50显示出比ARP70更大的体外羟自由基清除能力。

ARPs对超氧阴离子自由基的清除能力如图2D所示。ARP50对超氧阴离子自由基的清除率随浓度的增加而逐渐增加，而ARP70没有明显的剂量反应关系。ARP50的EC50为18.03mg/mL，而ARP70为22.21mg/mL。因此，ARP50在体外表现出更强的清除超氧阴离子自由基的能力。

3. ARPs减轻APAP诱导的急性肝损伤

小鼠肝脏的形态外观和H&E染色如图3B&C所示。与对照组相比，模型组的肝脏表现出增大、粗糙质地、颜色强度降低、表面有明显的白点状突起，以及显示裂纹状纹理的脆性边缘。不同剂量的ARPs给药在不同程度上减轻了小鼠的肝脏损伤。此外，随着剂量的增加，肝脏表面的白点状突起逐渐减少，恢复光泽。H&E染色显示APAP导致肝小叶出血、坏死和炎性细胞浸润。同时，坏死区域周围出现肝细胞气球样变性。ARP50和ARP70可以以剂量依赖的方式缓解这些症状。

图3 ARPs减轻了APAP诱导的急性肝损伤。（A）小鼠模型建立和治疗的流程图。（B）小鼠肝脏形态外观和H&E染色的代表性照片。（C）肝脏指数评估和肝脏坏死区域的定量（n=6）。数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计分析。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

小鼠血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）水平可作为肝损伤严重程度的指标。如图4A所示，50H和70H显著降低了AST和ALP水平（P<0.05），70H显著减弱了ALT水平（P<0.01），表明不同剂量的ARPs对APAP引起的急性肝损伤具有保护作用。肝GSH的耗竭通常被认为是APAP诱导肝毒性的起始因素。因此，评估小鼠肝脏中GSH、SOD、GPX4和MDA的水平，以评估肝脏抗氧化系统的变化，如图4B所示。与模型组相比，50H和70H时肝脏GPX4和GSH水平显著升高（P<0.05）。此外，在ARP70高剂量给药的影响下，肝脏MDA含量显著降低（P<0.05），同时SOD水平升高，表明ARPs可以增强抗氧化能力，对抗APAP诱导的肝损伤。此外，我们的研究结果显示，模型组肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高（图4C）。然而，50H和70H可以显著减轻这些增加（P<0.001），表明ARP减少了APAP诱导的炎症，对肝脏起到了保护作用。

图4 ARPs改善了APAP引起的异常化学指标（n=6）。（A）血清ALT、AST、ALP水平。（B）肝组织中GSH、SOD、GPX4和MDA水平。（C）肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计分析。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

4. ARPs调节肝脏代谢谱

代谢组学用于进一步研究ARPs对APAP诱导的急性肝损伤的保护机制。主成分分析（PCA，图5A）揭示了C、M、50H和70H组之间不同的代谢特征。随后，我们采用倍数变化（FC）>1.5和P<0.05的标准来确定C组与M组、M组与50H组和M组与70H组之间的差异代谢物（图5B）。如图5C所示，与C组相比，M组251种代谢物上调，421种代谢物下调。与M组相比，50H组下调128种代谢物，上调106种代谢物，而70H组下调498种代谢物，下调44种代谢物。50H和70H可以分别恢复57和161种异常上调的代谢产物，以及24和27种异常下调的代谢产物。此外，通路分析和差异代谢物的变化（图5D&E）表明，这些差异代谢物主要在精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、戊糖磷酸通路和谷胱甘肽代谢中富集，表明ARPs可能通过调节肝脏中L-谷氨酸的合成和代谢来减轻APAP诱导的急性肝损伤。

图5 ARPs改善了APAP引起的肝代谢紊乱（n=6）。（A）对照组（C）、模型组（M）、高剂量ARP50组（50H）和高剂量ARP70组（70H）的主成分分析（PCA）分析。（B）C与M、M与50H和M与70H的火山图。（C）C与M、M与50H、C与M和M与70H的维恩图。（D）50H和70H调节的差异代谢物的通路分析和（E）热图分析。在通路分析中，50H调节的代谢通路以蓝色标记，而70H调节的则以黑色标记。

5. ARPs重塑了肠道微生物群

据观察，APAP引起的肝损伤通常伴随着肠道微生物群的紊乱。在我们的研究中，我们对C组、M组、50H组和70H组的小鼠盲肠内容物进行了16S rRNA测序。结果（图6A）显示，ARPs可以将α多样性调节到正常水平（P<0.05）。此外，在主坐标分析中，C、M、50H和70H组之间的微生物群落结构明显分离（PCoA，图6B），表明APAP诱导的肠道微生物群失调可能受到ARP的调节。进一步的分析表明，门和属水平的微生物丰度存在显著差异。此外，我们在门（图6C，前19）和属（图6D，前16）水平上观察到微生物组成的显著差异。此外，线性判别分析效应大小（LEfSe）分析（图6E）突出了C组和M组、M组和50H组以及M组和70H组之间明显的细菌分类群差异。对这些高度富集的优势细菌属的相对定量分析表明，50H显著降低了Pseudarthrobacter的水平，显著提高了Faecalibacterium的水平。同时，70H显著增加了Dubosiella、Muribaculum、Ileibacterium和Prevotellaceae UCG-001的丰度，同时降低了Escherichia Shigella和Pseudarthrobacter的丰度。这些发现表明，ARPs可能通过调节肠道微生物群失调来发挥保肝作用。

图6 ARPs重塑了肠道微生物群（n=3）。（A）α多样性基于肠道菌群的Shannon指数、Fisher指数和observed species。（B）微生物组成的主坐标分析（PCoA）。（C）门水平和（D）属水平肠道微生物群的相对丰度。（E）C与M、M与50H和M与70H的LEfSe分析。50H（F）和70H（G）对肠道细菌属相对丰度的影响。数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计分析。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

碳水化合物通常由肠道微生物群代谢产生短链脂肪酸，对身体有益。分析显示，50H显著增加了血清和肝脏中的乙酸水平（图7）。此外，在50H和70H的影响下，肝脏中的丙酸含量显著升高。然而，血清或肝脏中的2-甲基丁酸水平没有变化（补充材料）。

通过Pearson相关分析（|相关系数|>0.8，图8），我们进一步证明在APAP和ARPs给药的影响下，小鼠的生化指标、肝脏代谢产物和肠道微生物之间存在明显的相关性。基于上述信息，如图9所示，ARPs可以重塑肝脏代谢功能并调节微生物组成，以改善APAP诱导的肝损伤。

图7 ARPs影响下血清（A）和肝脏（B）中乙酸和丙酸水平的变化（n=5）。数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计分析，与模型组相比**P<0.01和***P<0.001。

图8 50H组（A）和70H组（B）生化指标、肝脏代谢产物和肠道微生物之间的相关网络图。圆圈的大小表示程度，圆圈的颜色表示类别。蓝线表示物体之间的负相关，而红线表示正相关。

图9 代谢调节网络、生化指标和肠道微生物的示意图，说明APAP诱导的急性肝损伤在50H（标记为“*”）和70H时得到改善。红色字符表示受ARP影响的对象水平的上调，而蓝色字符表示下调。代谢物之间的虚线箭头表示多步生成，代谢物之间的实线箭头表示一步生成。

发烧和头痛是各种疾病最常见的表现。随着解热镇痛药的广泛使用，APAP引起的肝损伤越来越受到人们的关注。确定安全有效的解毒药物以减轻APAP引起的肝损伤至关重要。本研究采用水提取和醇沉法从泽泻中提取粗多糖。随后，我们对ARPs进行了表征，并研究了它们对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的治疗作用。

在这项研究中，我们通过分级乙醇沉淀获得了50%乙醇沉淀组分和70%乙醇沉淀组分。我们的分析揭示了两个组分中相似的官能团。然而，ARP50和ARP70在单糖组成上表现出显著差异。ARP50显示出更高的葡萄糖含量。此外，我们对ARP50和ARP70进行了淀粉分析，发现ARP50含有（6.07±0.60）%的支链淀粉，而ARP70中没有检测到淀粉，这可能解释了ARP50中葡萄糖含量高于ARP70的原因。

对乙酰氨基酚（APAP）是全球使用最广泛的传统解热镇痛药物。意外或故意摄入过量APAP已成为药物性急性肝衰竭的重要原因。在治疗剂量下，大多数APAP在肝脏中经历葡萄糖醛酸化和硫酸化，将其转化为无害的代谢物，随后通过肾脏途径排泄到尿液中。然而，过量的APAP主要通过细胞色素P450系统（包括CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4）代谢为N-乙酰基对苯醌亚胺（NAPQI），其具有很强的亲电性和氧化性。这个过程导致抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的大量消耗，导致随后与蛋白质上的半胱氨酸残基发生反应，形成蛋白质加合物。因此，细胞氧化还原稳态被破坏，引发氧化应激反应、线粒体损伤，最终导致细胞死亡。越来越多的证据支持多糖的抗炎、抗氧化和免疫调节特性。初步的体外自由基清除实验表明，ARPs表现出潜在的抗氧化活性，特别是对体内氧化应激过程中常见的副产物羟基自由基和超氧阴离子，这意味着ARPs在治疗APAP诱导的肝损伤方面具有潜在的治疗作用。体内药效学评估证实了这一点，肝脏氧化还原稳态的恢复以及GSH、SOD和GPX4水平的升高就是证明。此外，MDA水平的降低表明ARPs减轻了肝脏中的脂质过氧化。此外，APAP过量引起的广泛肝细胞坏死引发炎症反应。库普弗细胞被激活，并招募来自单核细胞的中性粒细胞和巨噬细胞作为主要的浸润细胞。转录调节因子如NF-кB被活化的库普弗细胞激活。这导致炎症因子水平升高，并介导其他炎症介质，从而加剧肝脏炎症和组织损伤。ARP50和ARP70均显示出炎症因子水平的剂量依赖性降低，从而缓解了炎症反应。在某些药效学指标上，70H比50H显示出更显著的治疗效果，这可能是由于50H中存在一些支链淀粉，降低了其疗效。尽管抗性淀粉可以通过肠道微生物群的发酵产生SCFA，对身体产生有益的影响，但淀粉在ARP中的具体影响需要进一步研究。

为了研究ARPs是否有助于肝脏抗氧化系统的重建，我们分析了肝脏的代谢特征。与ARP70相比，ARP50对肝脏代谢调节的影响较小，但两者都影响肝脏中的谷胱甘肽代谢。过量APAP可能导致肝半胱氨酸缺乏和谷胱甘肽耗竭，同时氧化型谷胱甘肽水平升高。这一过程触发了肝脏中胱氨酸谷氨酸逆向转运蛋白xCT的代偿性上调，导致谷氨酸分泌增加。ARPs可以提高半胱氨酸和谷胱甘肽水平，从而恢复L-谷氨酸水平。此外，70H可以降低L-同型半胱氨酸和S-腺苷-L-同型半胱氨酸的水平，从而减轻炎症和内质网应激。此外，肝脏中的S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）参与了核酸和蛋白质的甲基化反应，但过量的SAM被代谢为有毒的甲基化抑制剂。在APAP的影响下，牛磺胆酸水平升高，诱导炎症基因的表达，促进肝纤维化。模型组牛磺酸的异常升高可能代表了APAP诱导的肝细胞损伤引起的代偿性变化，有助于缓解氧化反应和内质网应激。此外，琥珀酸增加可以通过其同源受体琥珀酸受体1（SUCNR1）在肝脏驻留星状细胞和巨噬细胞群中的连接来驱动炎症。70H可提高泛酸水平，增强抗凋亡蛋白BCL2的表达，下调促凋亡蛋白BAX和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（pERK 1/2）的水平，缓解细胞凋亡。组胺的主要代谢产物1-甲基组胺的增加表明组胺代谢加速，减轻了组胺介导的胆管增殖和纤维化。在APAP的影响下，精氨酸生物合成过程中瓜氨酸和天冬氨酸水平的异常升高意味着精氨酸合成受阻，影响蛋白质、肌酸、多胺和一氧化氮（NO）的合成，从而影响正常的细胞生长代谢。此外，烟酸水平可以提高70H，这在增强细胞抗氧化能力、调节能量代谢和细胞保护方面具有重要意义。此外，70H的给药增强了肝脏的再生功能。这种增强伴随着ATP生成、糖酵解和线粒体呼吸加速的增加，从而改善了NAD的消耗并降低了其水平。在磷脂酰胆碱和鞘脂代谢途径中，我们观察到磷脂和鞘脂水平升高，脂肪酸链饱和度较低，比如PE（18:0/18:0），SM（d18:1/16:0），PE（34:0）、PC（14:0/18:2）、LPC（16:0）、PC，这可能是由于肝脏氧化还原平衡的破坏以及活性氧引发的脂质过氧化。此外，APAP诱导磷脂酶活性和胆碱激酶（Chka）mRNA/蛋白表达增加，磷脂酶mRNA表达降低，导致PC水平升高。此外，APAP可以降低肝脏磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）的表达，从而改善PE水平。70H可以将紊乱的脂质调节到正常水平。此外，ARP50可以通过调节戊糖磷酸途径来增强身体的抗氧化能力。NADP+和6-磷酸-D-葡萄糖酸的减少可能与NADPH合成速率的增加有关，NADPH合成维持了内源性抗氧化剂的减少状态，从而消除了活性氧和自由基。

另一方面，APAP会破坏肠道稳态，从而影响肝脏健康。ARPs对五个属微生物的丰度具有显著的调节作用。研究表明，Faecalibacterium、Dubosiella、Ileibacterium、Muribaculum和Prevotelaceae UCG 001的丰度与炎症反应呈正相关，而Escherichia Shigella和Pseudarthrobacter丰度的减少通常与炎症的缓解有关。在50H的影响下，Faecalibacterium的丰度显著增加，表明乙酸盐水平升高。这归因于Faecalibacterium利用乙酸盐作为丁酸盐生产碳源的显著能力。研究表明，肠道微生物群发酵碳水化合物产生的SCFA部分通过肠道上皮细胞吸收到血液中，而一些则通过门静脉直接进入肝脏。我们测量了血清和肝脏中SCFA水平的变化，发现50H显著增加了两者的乙酸盐水平。然而，由于大部分丁酸盐被结肠细胞吸收，我们没有观察到丁酸盐水平显著升高。此外，我们发现50H和70H都显著提高了肝脏中的丙酸水平。到达肝脏的乙酸盐不仅是能量来源，也是胆固醇和长链脂肪酸合成的底物，同时也是谷氨酰胺和谷氨酸合成的共底物。另一方面，丙酸主要被认为是肝脏糖异生的底物，在能量代谢中发挥作用。

结论

综上所述，ARP50和ARP70是通过梯度乙醇沉淀从泽泻中获得的。它们主要由不同比例的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，在体外表现出显著的抗氧化活性。进一步的研究表明，ARPs通过调节肝脏L-谷氨酸的合成和代谢以及改善肠道微生物群的失调来发挥保肝作用。这项研究扩大了ARP的潜在应用和价值，同时为临床环境中APAP诱导的肝损伤提供了一种可行的治疗选择。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39631232/

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