【写在前面】：本期推荐的是由同济大学医学院上海市第十人民医院能量代谢与健康研究所范理宏团队近期发表于Autophagy(IF14.6）的一篇文章，揭示黄芩素作为“分子胶”靶向促进CD274/PD-L1自噬降解以增强抗肿瘤免疫。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Baicalein tethers CD274/PD-L1 for autophagic degradation to boost antitumor immunity

2024年12月22日，同济大学医学院上海市第十人民医院能量代谢与健康研究所范理宏团队在Autophagy（IF=14.6）上发表了题为“Baicalein tethers CD274/PD-L1 for autophagic degradation to boost antitumor immunity”的文章，研究揭示黄芩素（Baicalein）能够以“分子胶”的形式靶向结合CD274增强PD-L1-LC3相互作用，然后促进PD-L1自噬降解，最终重新激活T细胞介导的抗肿瘤免疫，从而抑制肿瘤生长。因此，研究阐明了自噬-溶酶体通路在介导PD-L1降解中的关键作用，证明设计一种分子“胶”来拴住CD274-lc3相互作用是开发CD274抑制剂治疗癌症的一个有吸引力的策略。

摘要

免疫检查点抑制剂，尤其是靶向CD274/pd-l1的免疫检查点抑制剂具有强大的临床疗效。尽管基于抗体的cd274药物的开发已经取得了很大进展，但用于降解cd274的化合物在很大程度上仍然无法获得。在此，我们筛选并验证了黄芩素，一种传统中药单体，靶向CD274并诱导其大自噬/自噬降解。此外，我们证明了cd274直接与微管相关蛋白1轻链3β (MAP1LC3B)相互作用。有趣的是，黄芩素增强了CD274- lc3的相互作用，从而促进了CD274的自噬-溶酶体降解。重要的是，黄芩素介导的靶向CD274降解通过增强t细胞介导的抗肿瘤免疫抑制肿瘤发展。因此，我们阐明了自噬-溶酶体途径在介导CD274降解中的关键作用，并从概念上证明了设计一种分子“胶”来拴住CD274- lc3相互作用是开发CD274抑制剂治疗癌症的一个有吸引力的策略。

1.黄芩素靶向 CD274 的鉴定及其在蛋白质水平上表达的减少

为了确定CD274抑制剂的新型适用替代品，在2694种已知结构的中药单体中，建立了这些化合物与人CD274（PD-L1，PDB ID：6PV9）的X射线晶体结构相互作用的分子对接模型，使用薛定谔软件进行（图1A）。蛋白质印迹分析（图1B）介绍了 10 种化合物对 A549 细胞中 CD274 蛋白水平的影响。值得注意的是，黄芩素（化合物 5）显著降低了 A549 细胞中 CD274 的丰度。我们通过蛋白质印迹分析进一步研究了黄芩素对不同非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞（H1299、A549 和 LLC）中 CD274 丰度的影响。很明显，在 H1299、A549 和 LLC 细胞中，连续浓度的黄芩素干预 48 小时，黄芩素以剂量依赖性方式降低 CD274 的量（图 1C-E）。免疫荧光结果与蛋白质印迹分析一致（图1F-H）。综上所述，这些结果表明黄芩素对 CD274 的抑制作用可能与蛋白质稳态有关，而不是与转录过程有关。

一致地，使用黄芩素和CD274晶体结构（PDB ID：6PVP）的分子对接模型，表明黄芩素嵌入CD274的晶体结构中，通过氢等非共价相互作用形成稳定的复合物（图1I）。与我们的假设一致，免疫印迹结果（图1J）显示CD274被黄芩素拉下来，而A549细胞裂解物与预先与生物素或生物素-黄芩素偶联的链霉亲和素琼脂糖珠一起孵育。使用 Biocore 平台通过表面等离子共振 (SPR) 测定证实了黄芩素和 CD274 之间的相互作用。因此，估计黄芩素与 CD274 蛋白结合的平衡解离常数 (KD )约为 2.54 µM（图1K）。鉴于这些结果，证明黄芩素可以与 CD274 相互作用，降低蛋白质稳态中 CD274 的丰度，并且可能是肺癌的潜在 CD274 抑制剂。

图 1.鉴定黄芩素靶向 CD274 并在蛋白质水平降低其表达

2.黄芩素通过 CD274 增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫来限制肿瘤发展

由于黄芩素抑制CD274表达，我们建立了一系列体内和体外实验实验，以进一步研究黄芩素是否通过调节CD274影响后续T细胞介导的抗肿瘤免疫。首先，我们将LLC细胞接种到C57BL/6中，建立皮下肿瘤模型，然后用抗CD274单克隆抗体或黄芩素治疗动物18天。用黄芩素或抗CD274治疗后肿瘤生长受到抑制（图2A、B），并且很明显，黄芩素组或抗CD274组在18天时的肿瘤体积是缩略图（图2C）。这些结果证明黄芩素在肺癌治疗中发挥与CD274单克隆抗体相似的致癌作用。我们还深入研究了黄芩素是否影响 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，并在我们的小鼠模型中进行了肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 谱分析。使用免疫组织化学 (IHC) 测定，在黄芩素治疗的小鼠肿瘤中观察到CD274 +肿瘤细胞数量减少（图2D、E）和流式细胞仪分析（图2F、G）。此外，IHC 测定表明，黄芩素显著增强肿瘤组织中 CD4 +和 CD8 + T 细胞的浸润，并增加 GZMB（颗粒酶 B）阳性和 PRF1（穿孔素 1）阳性细胞的频率（图2D、E）。总之，这些结果表明，黄芩素可以增强 T 细胞浸润，然后促进 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，与皮下肿瘤模型中 CD274 表达的降低一致。

为了进一步证实黄芩素对CD274表达和相应T介导的抗肿瘤免疫的影响，我们通过CRISPR-Cas9基因组编辑构建了CD274敲除（KO）LLC细胞系；通过蛋白质印迹分析验证了敲除效率。然后，我们使用皮下肿瘤模型研究了黄芩素和抗 CD274 抗体在不存在 CD274 的情况下的抗肿瘤作用，其中将CD274 KO LLC 细胞注射到 C57BL/6 小鼠中。在没有CD274的情况下，黄芩素或抗CD274抗体治疗后的肿瘤生长和肿瘤体积与对照组相比没有显著差异（图2H-J）。总的来说，这些体外和体内结果一致证实黄芩素通过调节 CD274 增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫。关于 TME 中 T 细胞介导的对肿瘤细胞的细胞毒性，T 细胞上的 PDCD1 与肿瘤上的 CD274 的结合对于损害抗肿瘤免疫并促进肿瘤免疫逃逸至关重要。我们还在体外研究了黄芩素是否影响 PDCD1-CD274 结合和 T 细胞介导的抗肿瘤免疫。首先，我们将肿瘤细胞与纯化的 FITC 标记的人 PDCD1 蛋白一起孵育，以追踪肿瘤细胞中 PDCD1 与 CD274 的结合。流式细胞术（图2K，L）和免疫荧光测定显示黄芩素处理的H1299细胞中PDCD1-CD274结合的比率显著下降。随着PDCD1-CD274结合的减少，抗肿瘤免疫反应和T细胞肿瘤杀伤作用增强。因此，这一假设也与使用癌细胞阻抗测定法共培养 Jurkat T 细胞的结果一致。具体而言，在黄芩素干预下，将H1299细胞与Jurkat T细胞共培养，并通过结晶紫染色检测存活的肿瘤细胞。黄芩素显著降低 H1299 细胞的存活率，并伴有 CD274 减少（图2M、N）。这些发现证明黄芩素可减少 PDCD1-CD274 结合并增加 T 细胞对癌细胞的细胞毒性。

图 2.黄芩素通过 CD274 增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，从而限制肿瘤发展

3.CD274 与 LC3 相互作用

鉴于黄芩素对蛋白质稳态中 CD274 的数量和功能的抑制作用，我们随后与溶酶体抑制剂（氯喹 [CQ]）共同孵育或蛋白酶体抑制剂（MG132）用黄芩素治疗。很明显，在 H1299、A549 和 LLC 细胞中，与 CQ 共孵育可显著阻止黄芩素介导的 CD274 降解，但与 MG132 则不能（图3A-C）。这表明黄芩素介导的CD274水平水平不仅与自噬-溶酶体途径的促进有关。生物信息学分析揭示了CD274中存在保守的 LIR 基序（121-126 和 132-137，图3D），这暗示了 CD274 和 LC3B 直接相互作用的可能性。随后，利用纯化 His 标记的 CD274 和 HA 标记的 LC3B，亲和分离测定明确证实了 CD274 和 LC3B 的直接相互作用（图3E）。我们通过双分子荧光互补（BiFC）测定进一步追踪了 HeLa 细胞中 CD274 和 LC3B 的相互作用（图3F）。结果表明，CD274 和 LC3B 在 HeLa 细胞内相互作用，在图像中看到 GFP 荧光。通过用 CQ 抑制 CD274 自噬降解来增强其作用。类似地，相互作用的蛋白质 CD274 和 LC3B 在溶酶体内共存，这是通过 LysoTracker Red 染色标记的（图3G）。定量地，我们还采用微尺度热泳（MST）测定来揭示CD274与LC3B的结合亲和力，并通过评估黄芩素与CD274蛋白的结合来确定平衡解离常数（KD ），其约为108nM（图3H）。这些数据揭示CD274直接与LC3B形成稳定的蛋白质复合物。我们还通过分子对接模型检查了 CD274 和 LC3B 的相互作用，该模型证明 CD274 和 LC3B 在其相互作用界面上形成稳定的蛋白质复合物（图3I）。总之，这些发现系统地表明 CD274 与 LC3B 相互作用以触发 CD274 自噬降解。

图3.CD274 与 LC3 相互作用

4. 黄芩素增强 CD274 和 LC3B 之间的相互作用

鉴于CD274与LC3B和CQ相互作用表明它们都驻留在溶酶体中，我们随后研究黄芩素是否增强CD274-LC3B相互作用并促进CD274自噬降解。免疫共沉淀测定表明 CD274 和 LC3B 之间存在物理相互作用，并且黄芩素增强了 CD274-LC3B 相互作用（图4A）。BiFC结果表明CD274与LC3B相互作用并定位于溶酶体，黄芩素显著促进CD274与LC3B相互作用（图4B）。测得黄芩素与CD274的结合亲和力KD为2.54μM；使用 SPR 测定还表明，黄芩素与 LC3 的结合亲和力的 KD 为 3.6 µM（图4C），这些发现表明黄芩素与 CD274 或 LC3B 形成稳定的复合物。结合之前在CD274和LC3B中的MST结果，表明黄芩素可能作为分子“粘合剂”来促进CD274-LC3B相互作用。上述数据一致表明，黄芩素促进CD274和LC3B的相互作用，并将CD274靶向溶酶体进行自噬降解。与此同时，黄芩素促进 CD274 与 LC3B 结合，之后它们被招募形成自溶酶体。在自溶酶体中，CD274 被溶酶体水解酶降解。

图 4.黄芩素增强 CD274 和 LC3B 之间的相互作用

5.CD274 的 E31 和 A132-Q139 是黄芩素增强其与 LC3B 相互作用所必需的

为了进一步阐明黄芩素调节CD274-LC3B相互作用的具体机制，我们构建了一系列缺乏不同结构域的CD274突变体。首先，根据 iLIR 预测 CD274 含有 2 个保守的 LIR（121-126 和 132-137 结构域），我们采用 co-IP 测定来验证黄芩素对 LC3B 与删除了 LIR 结构域的突变 CD274 结合的促进作用。结果表明，LIR 结构域对黄芩素的促进作用可能影响不大（图5A）。考虑到CD274结构中的两个对称链片段和132-137区域是连接子，我们随后单独构建了1-132和132-290截断子。因此，我们发现两个 CD274 截短子都能够与 LC3B 结合，并且黄芩素增强了这些相互作用（图5B）。此外，还建立了黄芩素与X射线晶体结构CD274和LC3B蛋白复合物的分子对接模型（图5C），注意到CD274的E31和N138/Q139也可能是黄芩素促进的重要因素。此后，通过CD274进化保守的E31或N138/Q139至丙氨酸建立突变体CD274。然而，相应的co-IP结果表明CD274的区域（E31或N138/Q139）并没有消除CD274-LC3B相互作用中黄芩素的促进作用（图5D）。考虑到CD274中存在组合突变和连接子(132-137)的可能性，我们最终构建了具有E31A和132-139缺失突变的CD274突变体(E31A/Δ132-139)。如 co-IP 结果所示，该突变显著减弱了黄芩素增强 CD274-LC3B 结合的作用（图5E）。总的来说，这些发现表明黄芩素需要 CD274 的 E31 和 A132-Q139 来增强 CD274 和 LC3B 之间的相互作用。

图 5.CD274 的 E31 和 A132-Q139 是黄芩素增强其与 LC3B 相互作用所必需的

6.黄芩素介导的 CD274 自噬降解是其抗肿瘤作用所必需的

在调节 CD274-LC3B 相互作用所需的黄芩素区域的提示下，我们用全长CD274 (WT) 和组合突变体 (E31A/Δ132–139) CD274 (MT) 重建了CD274 KO LLC 细胞，以确认黄芩素效应和随后的 T 细胞介导的抗肿瘤免疫。结果表明，黄芩素仅在 WT CD274 LLC 中促进 CD274 降解，而在 MT CD274 LLC 中则不促进 CD274 降解（图6A、B），这验证了我们的假设，黄芩素促进 CD274 靶向降解与 CD274-LC3B 相互作用密切相关。此后，我们评估了黄芩素对WT CD274和MT CD274 LLC细胞的体内抗肿瘤作用。这表明黄芩素未能抑制MT CD274 LLC荷载小鼠的肿瘤生长，但黄芩素仍然可以限制WT CD274 LLC荷载小鼠的肿瘤发展(图6C-E）。相应地，两种 IHC 检测（图6F、G）证明，在MT CD274 LLC荷载小鼠中，用黄芩素处理后，CD274 +细胞数量没有显着变化，而在WT CD274 LLC中，CD274 +细胞数量出现显着变化。用黄芩素治疗后的小鼠。由此可见，黄芩素并不影响MT CD274 LLC 小鼠肿瘤中CD4 +和 CD8 + T 细胞的浸润，如 IHC 测定所示（图6F、G）。同样，黄芩素不再增加 MT CD274 LLC 小鼠肿瘤中 GZMB 阳性细胞和 PRF1 细胞的频率。相反，WT CD274 LLC 小鼠的肿瘤对黄芩素治疗表现出更好的反应， WT CD274 LLC 小鼠肿瘤中有 CD4 +和 CD8 + T 细胞浸润，以及 GZMB 阳性和 PRF1 阳性细胞的频率黄芩素治疗后（图6F、G）。综上所述，这些体内结果说明CD274的区域（E31和A132-Q139）对于黄芩素促进CD274靶向降解和相应的抗肿瘤作用至关重要，也验证了我们之前关于黄芩素促进CD274-LC3B相互作用的推测。以 CD274 自噬降解为目标，然后增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，从而抑制肿瘤生长（图7）。

图 6.黄芩素介导的 CD274 自噬降解是其抗肿瘤作用所必需的

结论

总之，我们的研究记录了一种用于靶向 CD274 降解的创新小分子抑制剂。在此过程中，黄芩素促进CD274-LC3相互作用，增强CD274的自噬降解，增强T细胞介导的抗肿瘤免疫，并抑制肺癌的发展。这些发现为阐明中药抗癌新分子机制提供了重要信息。这些结果应该会刺激新的研究方向，因为它为开发新型小分子 CD274 抑制剂提供了合理的机制基础和理论见解。

黄芩素作为分子胶，促进 CD274-LC3B 相互作用，从而促进 CD274 的自噬降解。最终，黄芩素会削弱 PDCD1-CD274 结合并增强 T 细胞抗肿瘤免疫力，从而抑制肺癌的发展

Hao B, Lin S, Liu H, Xu J, Chen L, Zheng T, Zhang W, Dang Y, Reiter RJ, Li C, Zhai H, Xia Q, Fan L. Baicalein tethers CD274/PD-L1 for autophagic degradation to boost antitumor immunity. Autophagy. 2024 Dec 22:1-17. doi: 10.1080/15548627.2024.2439657.

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