Nat Commun丨假如给我三天光明：Ziapin2在视网膜退化治疗中的新曙光

《动物模型构建与行为学评估》电子版pdf，网盘发货

《动物模型构建与行为学评估》V1.0共计约540页， 主要围绕生物医学领域中动物实验的核心方法，详细介绍了如何通过构建动物模型来研究疾病机理，并且使用行为学评估手段验证这些模型的有效性。书中的内容适用于研究人员在进行神经科学、药理学、生物医学等领域的实验时，理解和运用动物模型这一重要工具。

视网膜能够通过将视觉信息分离成不同的平行通道以同时处理正负对比度在ON和OFF通路中，从而提取和识别环境中的视觉特征，如空间组织或运动，这种处理视觉信息的能力远超现代最先进的相机。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）分为30多种功能类型，分别对光和暗作出不同反应，而视觉信息的分离和对比度编码最初在光感受器带状突触处生成，通过水平细胞的抑制性环绕和双极细胞（bipolar cells, BCs）的正负对比度分离实现。外周视网膜的杆状BCs通过缝隙连接直接兴奋锥状ON-BCs，并通过AII无长突细胞的甘氨酸能突触（AII amacrine cells’ glycinergic synapses）抑制锥状OFF-BCs，从而调节对比度敏感性。视网膜光感受器的退化是导致严重视力损伤的常见原因，视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa, RP）和年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）是其中最常见的遗传性视网膜退化疾病，尽管RP和AMD的患病率高，但目前尚无有效的药物治疗方法。除了基因和细胞疗法外，科学家们还在探索光遗传学和视网膜假体等替代策略，以应对视网膜退化疾病。光遗传学技术已经在临床前模型中广泛测试，其视网膜假体通过生成光诱导的电信号来激活内视网膜，恢复部分光敏感性。新一代的偶氮苯光开关无需基因工程即可光敏化内源性蛋白，这些光开关对可见光敏感，并能在光照下可逆地阻断视网膜神经节细胞的电压或配体门控离子通道。然而，这些化合物只能在照明时调节视网膜网络，无法生成负对比度信息，因而在高空间分辨率和负对比度生成方面存在局限。

意大利技术研究院（Istituto Italiano di Tecnologia）的Fabio Benfenati和Stefano Di Marco团队设计了一种新型的两亲性偶氮苯光开关，命名为Ziapin2，其由一个偶氮苯核心、一侧有两个吡啶基封端的分支和另一侧的疏水氮杂环庚烷环组成。Ziapin2作用于膜的被动特性，不直接干扰离子通道或神经递质受体，能自发分布在膜的两层中。在黑暗中，Ziapin2分子通过氮杂环庚烷相互作用，减少膜厚度，增加电容，使神经元不易兴奋。通过毫秒级蓝绿色光脉冲（450-500 nm；峰值470 nm）触发的反式到顺式异构化导致膜松弛，电容急剧下降，引起神经元膜的快速超极化，随后反弹去极化。这些变化通过阳极破裂机制增加内在兴奋性，并触发动作电位（action potential, AP）发放。研究实验表明，通过作用于双极细胞，Ziapin2恢复了视网膜神经节细胞的光诱发反应，并恢复了失明小鼠的光驱动行为和视动反应，说明Ziapin2有望通过生理性地重新激活内视网膜处理过程来恢复视网膜退化晚期的视觉反应。该研究成果A membrane-targeted photoswitch restores physiological ON/OFF responses to light in the degenerate retina已发表在Nature Communications上。

图源 Nature Communications

因为Ziapin2具有双向调节神经元兴奋性的特性，促使研究人员测试其在视网膜中的效果。他们首先从有视力的野生型C56BL6/J小鼠（WT）中分离的全视网膜样本上进行膜片钳记录，观察单个RGCs对光的反应。首先，研究人员记录在2-20 mW/mm²功率密度下，500毫秒全场青光或绿光闪烁的基础反应；然后用第二个玻璃微管对贴片的RGC进行局部施用（2分钟喷射）载体（含有10% 二甲基硫氧化物DMSO的Ames培养基中）或Ziapin2（200 µM）。结果显示，Ziapin2融入RGC膜后，在青光刺激下相对于基础条件，显著增加了动作电位AP的发放，而载体处理的RGC在光刺激下无效。Ziapin2对青光诱发的发放活动的调节与刺激同步，并在15次刺激协议中保持一致；但当用绿光刺激同一RGC时，发放模式没有变化。PSTH分析和发放率计算证实，Ziapin2应用后，青光刺激可靠地增加了RGC的发放率，而载体处理的RGC或Ziapin2处理的RGC在绿光下则没有这种变化，提示Ziapin2处理的RGC对青光刺激的反应显著高于载体处理或绿光刺激。

图1 Ziapin2增强了WT视网膜中的光诱导RGC突触活性

为了确认Ziapin2在视网膜神经元中的光激发机制，研究团队研究了在黑暗或青光刺激下，处理过载体或Ziapin2的RGCs中生成的AP动态。与Ziapin2在黑暗中引起的电容增加一致，首次光诱发的AP显示出较慢的动态，去极化和复极化斜率及AP幅度显著降低。青光刺激通过阶段性减少电容，加速了AP动态，显著增加了去极化和复极化斜率及AP幅度。载体处理的RGCs在相同光刺激下未观察到AP动态变化。同样，Ziapin2处理但用绿光刺激的RGCs也未观察到光诱发的AP动态变化。低通滤波提取光刺激后1.5秒内的慢阈下膜电位振荡，结果显示光响应期间膜去极化峰值显著增加，而峰值后超极化未受影响。Ziapin2使去极化和恢复到基础膜电位的时间点与光刺激的开关精确对齐，显著同步了阈下光诱发的膜电位振荡，减少了响应变异性。

图2 光诱导的Ziapin2电容变化引起了WT视网膜中更快的动作电位动态和膜去极化

研究团队进一步测试了Ziapin2是否能恢复光敏感性和复杂的视网膜网络处理能力。通过对6个月大的rd10小鼠和大鼠的盲视网膜进行膜片钳实验，发现Ziapin2在青光刺激下显著增加了AP的发放，而对绿光刺激无效。为了确保所有未退化的视网膜神经元都能吸收Ziapin2，研究人员将视网膜样本浸泡在含有Ziapin2的溶液中，结果显示Ziapin2重新激活了多种RGC反应，包括对青光的ON和OFF反应，且在所有测试的光功率密度下，AP总数和瞬时发放率显著增加。通过共聚焦显微镜观察，青光诱发的反应与RGC树突在内丛状层的分层一致，表明Ziapin2使退化视网膜中的RGC恢复了自然的编码能力。此外还发现Ziapin2处理的视网膜在青光刺激下表现出多种RGC反应类型，包括瞬时和持续的ON反应、ON-OFF反应以及抑制的OFF反应。这些发现表明，Ziapin2不仅能恢复退化视网膜的光敏感性，还能重建复杂的视网膜网络处理能力。

图3 Ziapin2恢复了退行性变视网膜中的视网膜神经元细胞对光的正常反应

图4 Ziapin2可恢复退化的rd10视网膜在分离通道中分析视觉信息的能力

盲视网膜在光感受器丧失的同时，解剖和功能网络组织发生显著变化，导致RGCs接收光诱发突触输入和触发AP发放的能力受损，因此研究团队测试了Ziapin2是否能加速退化视网膜中RGCs的动作电位动态。他们首先验证了退化视网膜中的诱发发放确实是由Ziapin2的反式到顺式异构化引起的膜电容突然下降所触发。个别RGCs被局部喷射Ziapin2（200 µM）并用青光或绿光刺激，结果显示青光显著降低了RGC电容，而绿光无效。为了进一步了解Ziapin2对rd10视网膜样本中RGCs被动特性的电容效应，研究人员通过相平面图分析了AP动态变化。视网膜样本被Ziapin2（10 µM，30分钟）处理，并用青光激活Ziapin2或用绿光作为对照。在黑暗或绿光下，发放模式和AP波形没有变化，而青光刺激显著加速了AP动力学，增加了峰值幅度，并加快了去极化和复极化阶段。

图5 光诱导的Ziapin2电容变化导致了视网膜退行性rd10的动作电位动态加快和膜电位变化

图6 Ziapin2可恢复退化的rd10视网膜中RGC的光诱发兴奋和抑制突触输入

为了验证Ziapin2在体内作为潜在治疗工具的可能性，研究团队6个月大的失明rd10小鼠进行了玻璃体内注射（200

图7 体内注射Ziapin2后，失明的rd10小鼠恢复了对光的敏感性

图8 体内注射Ziapin2后，失明的rd10小鼠的视运动反应和RGC生理放电得到恢复

在这项工作中，研究团队设计了一种新型的两亲性偶氮苯光开关Ziapin2，其能够在退化的视网膜中恢复生理性的ON/OFF光反应。通过在小鼠和大鼠模型中的实验，研究人员发现Ziapin2能够重新激活视网膜神经节细胞的兴奋性和抑制性传导，恢复其对光的复杂处理能力。向失明小鼠的眼睛玻璃体内注射Ziapin2能够显著改善小鼠的光驱动行为和视动反应，表明其在视网膜退化晚期具有恢复视觉功能的潜力。因此，Ziapin2有望成为治疗视网膜退化疾病的新工具，进一步研究将探索其在不同视网膜退化条件下的治疗应用，期望能为遗传性和年龄相关性视网膜疾病患者带来视觉恢复的希望

原文地址

https://doi.org/10.1038/s41467-025-55882-2

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