【写在前面】：本期推荐的是由福建医科大学基础医学院研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示苏木酮A通过靶向小鼠中的Mup3减少肝细胞脂毒性，有效缓解与代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Sappanone A alleviates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by decreasing hepatocyte lipotoxicity via targeting Mup3 in mice

背景与目的：代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种炎症性脂毒性紊乱，其特征是肝脏脂肪变性、肝细胞损伤、炎症以及不同程度的纤维化。苏木酮A（SA）是一种黄酮类化合物，具有抗炎和保肝活性。然而，SA对MASH的影响尚不明确。我们评估了SA对MASH小鼠肝细胞脂毒性、炎症和纤维化状况的影响，以及其潜在的作用机制。

方法：采用传统的小鼠MASH模型，即喂食MCD饮食的小鼠，来评估SA在体内对MASH的作用。通过药物靶点预测和肝脏转录组学来阐明SA的潜在作用。AML12细胞被用于进一步探索SA在体外的效果和机制。

结果：计算机预测表明SA能够调节炎症、胰岛素抵抗、脂质代谢和胶原蛋白分解过程。SA剂量依赖性地降低了饮食诱导的MASH小鼠血清中ALT和AST的升高水平，且高剂量SA治疗的效果与水飞蓟素类似。此外，SA治疗显著减少了代谢应激下脂质沉积、炎症和纤维化的程度，且呈剂量依赖性。另外，SA减轻了棕榈酸诱导的肝细胞脂毒性。肝脏转录组学进一步证实了上述发现。值得注意的是，mRNA测序分析和分子生物学实验表明，SA显著上调了肝脏中主要尿蛋白3（Mup3）的表达，从而促进脂质运输并抑制脂毒性。此外，在肝细胞中敲低Mup3显著消除了SA提供的肝保护作用。

结论：SA通过减少肝细胞中的脂质积累和脂毒性来缓解MASH，至少部分是通过靶向Mup3实现的，进而阻断MASH进程。因此，SA有望成为MASH背景下的一种有前景的保肝剂。

（图文摘要）

【前言】

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，原称NASH），是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，原称NAFLD）的晚期形式，其特征是肝脏脂肪变性、炎症和进行性纤维化。它可能会发展为肝硬化和肝癌，尽管在临床上常常是无症状的。据估计，普通人群中MASLD的全球患病率约为30%，并且仍在以惊人的速度上升。然而，迄今为止，尚无批准的针对MASH及其并发症的有效治疗方法。因此，迫切需要开发针对这种高发疾病的有效治疗策略。

尽管目前MASH的分子发病机制尚不可预测，但在MASH的发展过程中，涉及的一个关键事件是由肝细胞中大量脂质沉积引起的脂毒性。当肝细胞无法通过将多余的游离脂肪酸（FFAs）包装成甘油三酯（TG）来管理这些额外的脂肪酸时，就会发生脂毒性，通常会导致脂肪细胞凋亡。在这种情况下，脂毒性期间受损的肝细胞会分泌各种因子，包括细胞因子和趋化因子，直接刺激肝脏中的驻留或循环巨噬细胞、窦状内皮细胞和肝星状细胞（HSCs），以及招募其他免疫细胞类型。在不同肝内细胞类型相互作用的背景下，持续的肝脏炎症反应和过多的纤维积累会导致肝纤维化甚至肝硬化。相应地，肝内细胞通过释放分子进行的相互交流将脂毒性与炎症和纤维化联系起来，从而促进MASH的发展。

载脂蛋白在脂质运输中起着关键作用。它们的主要功能是作为脂蛋白的结构成分，促进脂质通过血液和淋巴的运输。当载脂蛋白功能受限时，肝细胞内的脂质稳态会发生变化，导致肝脏损伤。因此，调节肝细胞中的脂质运输可以调节脂毒性的发生，并进一步影响MASH的进展。

主要尿蛋白（Mups）是一种载脂蛋白，它们具有保守的β-结构，使其能够作为各种疏水配体的转运蛋白，包括类固醇激素、信息素和脂质。Mups主要在肝脏中表达并释放到尿液中。排泄到尿液中的Mups作为信息素参与嗅觉交流，而体内循环的Mups被认为在脂质运输和外源性解毒中起着重要作用。迄今为止，许多研究已经证实Mups作为载脂蛋白参与肝脏脂质稳态。在遗传性和饮食诱导的肥胖和糖尿病以及能量摄入减少的情况下，Mup1或Mup5的表达和血浆含量显著降低。此外，Mup1可以通过其疏水结构与棕榈酸（PA）结合，并改善线粒体功能障碍。此外，在糖尿病模型中，补充重组Mup1显著降低了高血糖。观察到在低密度脂蛋白受体缺陷小鼠中Mup19的表达下调，而在给予低脂高碳水化合物饮食的小鼠中表达下调，而在喂食颗粒饲料的小鼠中表达增加，表明Mup19可能有助于脂质代谢。Mup3与其他Mup家族成员具有相似的功能，并有助于脂质代谢。因此，Mups可能作为减轻MASLD或MASH的有希望的治疗靶点。

生活方式的改变，如饮食干预和运动训练，仍然是MASLD患者的核心建议。然而，对生活方式改变的依从性差是管理MASLD的一个重大挑战，使得药物治疗对于治疗MASLD及其进展阶段MASH变得不可或缺。然而，目前尚无专门针对MASLD和MASH患者的批准药物。包括胰高血糖素样肽-1受体激动剂、核受体激活剂（例如，elafibranor和GFT505）和胰岛素增敏剂（例如，glitazones，metformin）在内的几种药物仍在MASH的药物研发管线中。因此，针对进展性MASH的治疗药物开发存在未满足的医疗需求。传统中药（TCM）因其为治疗MASH提供更多的选择而受到越来越多的关注。水飞蓟素（Sily）通过多种途径减轻MASH，包括调节脂质代谢、抗炎和抗氧化应激。值得注意的是，水飞蓟素已注册用于针对MASH治疗的4期临床试验。因此，水飞蓟素在本研究中被用作阳性对照药物。

苏木酮A（SA），是一种从Caesalpinia sappan Linn.中提取的生物活性同型异黄烷酮，具有多种药理作用，如抗炎和抗氧化活性。先前的研究表明，SA通过抑制糖尿病小鼠中的NF-κB信号通路减轻肾脏炎症和纤维化。此外，SA减轻了脑缺血再灌注损伤小鼠模型中内质网（ER）应激引起的炎症和氧化应激损伤。我们先前的研究进一步表明，SA通过调节小鼠中M2型巨噬细胞极化减轻了四氯化碳诱导的肝纤维化。然而，SA预防MASH的潜在机制尚不清楚。鉴于MASH以肝脏脂肪变性、炎症和纤维化为特征，我们假设SA可能在管理MASH方面发挥积极作用。因此，本研究利用体内MASH小鼠模型和体外脂毒性模型来探究SA的药理作用。此外，还对小鼠肝脏组织进行了mRNA测序分析，以阐明SA的相关作用靶点或途径。我们的研究可能会增强对SA对抗MASH保护机制的理解。

【结果】

1、苏木酮A可能阻碍MASH进展的潜在靶蛋白预测

通过PharmMapper服务器预测了苏木酮A的潜在靶蛋白。然后，在DAVID数据库中对GO和KEGG术语进行了富集。GO术语主要包括胶原蛋白分解过程、对脂多糖的响应、胰岛素信号通路、胆固醇储存的负向调控以及脂肪酸结合（图1E）。KEGG富集术语包括代谢途径、脂质和动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及IL - 17信号通路（图1F）。这些富集术语与脂质代谢、炎症和纤维生成密切相关，表明苏木酮A可能对MASH的进展具有延缓作用。

2、苏木酮A对MCD诱导的小鼠肝脏损伤的治疗效果

如前所述，小鼠分组并给药如图2A所示。记录了每只动物的肝脏重量或体重（图1A和2B - C）。与对照组相比，MCD喂养组的体重和肝脏重量均有所下降。然而，苏木酮A治疗部分逆转了这些效应并改善了它们。此外，中高剂量苏木酮A治疗组的体重和肝脏质量与水飞蓟素治疗小鼠相当（图2B和C）。尽管如此，苏木酮A治疗并未影响MCD喂养小鼠的肝脏指数（图2D）。为了评估苏木酮A对肝功能的影响，通过收集小鼠的血清样本测量了血清ALT和AST水平。我们观察到苏木酮A剂量依赖性地减轻了MASH小鼠的肝脏损伤，高剂量苏木酮A治疗小鼠的治疗效果与水飞蓟素治疗小鼠相似（图2E）。组织学（H&E）染色切片证明，中高剂量苏木酮A给药后，MCD喂养小鼠肝脏中MASH的严重程度显著减轻（图1F）。如图1G所示，中高剂量苏木酮A的注射显著改善了肝脏组织中的脂肪变性程度、NAFLD活动评分和肝脏微炎症，高剂量苏木酮A治疗的效果与水飞蓟素相似。一致地，苏木酮A治疗减少了MASH肝脏中的肝细胞死亡（补充图1B）。因此，苏木酮A对MCD诱导的小鼠肝脏损伤具有肝保护作用。

3、mRNA - seq基因的生物信息学分析和SNP分析

在阴性对照（NC，ND处理组）、苏木酮A（100 mg/kg）、MCD和MCD + 苏木酮A（100 mg/kg）组中，共鉴定出15988个重叠基因（图3A）。此外，在NC与MCD以及MCD与MCD + 苏木酮A组之间筛选出201个共同的差异表达基因（DEGs）（logFC = 1，p adjust < 0.05）（图3B）。主成分分析（PCA）显示不同组之间有明显的分离（图3C）。此外，火山图显示与NC相比，MCD中有376个下调的DEGs和493个上调的DEGs（图3D）。

此外，在MCD + 苏木酮A与MCD相比，有249个DEGs下调，199个DEGs上调（图3E）。基于这201个重叠的DEGs进行了KEGG、GO和GSEA分析。在NC和MCD组的比较中，GO术语主要映射到脂质代谢过程、免疫系统过程和胶原纤维组织，而KEGG术语映射到PI3K - Akt、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和MAPK途径（图3F）。相反，在MCD和MCD + 苏木酮A组之间，GO术语主要与脂质代谢过程、免疫系统过程、细胞外基质（ECM）和胰岛素受体活性有关，而KEGG术语则集中在PPAR信号通路和炎症相关途径上（图3G）。

4、苏木酮A抑制MASH小鼠的肝内脂肪生成

5、苏木酮A抑制肝脏脂质合成并促进脂质代谢

如图5A和B所示，与对照组相比，在MCD喂养小鼠中观察到脂肪生成相关基因表达升高以及脂肪酸β - 氧化相关基因表达降低，而苏木酮A治疗逆转了这些效应。此外，苏木酮A治疗显著增加了脂肪酸分解相关基因的表达，包括细胞色素P450（Cyp）2e1、Cyp3a11和Cyp4a10，在MASH模型中（图5C）。同样，DEGs的热图进一步证实了苏木酮A对MCD饮食诱导的脂肪变性的抑制效应（图5D）。因此，这些发现表明苏木酮A抑制肝脏脂质合成并促进脂质代谢，从而减轻MASH的严重程度。

6、苏木酮A治疗减轻MCD诱导的小鼠肝脏纤维化

异常的肝脏胶原蛋白积累会导致肝脏纤维化、僵硬和终末期肝病，这些是MASH最常见的致命肝脏后果。预防肝脏纤维化是为治疗MASH而设计的现代治疗方案的目标之一。随后，我们确定苏木酮A是否对MASH肝脏具有抗纤维化作用。

如图6A和B所示，西瑞红染色显示，在MCD + 苏木酮A处理的小鼠中，肝脏纤维化有显著改善，其纤维间隔比接受载体处理的MCD喂养小鼠更窄。GSEA进一步揭示了苏木酮A治疗增强了胶原蛋白代谢过程（图6C）。同样，DEGs的热图也进一步证实了苏木酮A的抗纤维化效应（图6D）。一致地，苏木酮A治疗减轻了纤维化组织中促纤维化基因的表达，包括α - 平滑肌肌动蛋白（αSMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Col1）、Ⅳ型胶原蛋白（Col4）、金属蛋白酶 - 1（TIMP1）和转化生长因子- β（TGFβ）（图6E）。总体而言，苏木酮A在MASH小鼠中表现出抗纤维化特性。

7、苏木酮A改善MASH小鼠的肝脏炎症

为了研究苏木酮A在肝脏炎症中的作用，通过免疫组化染色观察到与对照组相比，MASH肝脏中CD86 + 或F4 / 80 + 巨噬细胞的数量增加，这一现象可通过苏木酮A剂量依赖性地逆转（图7A - D）。qRT - PCR分析进一步支持了这些结果（补充图7A），苏木酮A治疗显著降低了相关炎症因子（肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL - 1β和IL - 6）的mRNA表达水平（图7E）。在ELISA中也观察到这些炎症因子的类似结果（图7F）。此外，苏木酮A治疗还降低了MASH环境中CXCL10在肝脏中的表达水平（补充图7B）。一致地，转录组测序结果显示，在MCD喂养的小鼠中，苏木酮A治疗后炎症反应下调（图7G）。所有这些数据表明苏木酮A可以显著减轻MASH小鼠的肝脏炎症反应。

8、苏木酮A减少代谢应激下肝细胞的脂质积累

为了进一步确认苏木酮A是否可以直接减少肝细胞中的脂质积累，使用PA构建了一个体外脂毒性模型。与对照小鼠相比，模型小鼠中观察到的升高的LDH含量反映了PA的脂毒性，而苏木酮A（10和100μM）治疗改善了PA诱导的细胞损伤（图8A）。我们还使用Bodipy荧光染料来展示细胞内脂质含量，发现苏木酮A治疗减轻了PA在肝细胞中产生的过度脂质沉积（图8B和C）。此外，苏木酮A还降低了PA处理的肝细胞中的TG和TC水平（图8D）。值得注意的是，相关脂肪生成基因的mRNA表达水平也表现出类似模式（图8E）。因此，这些发现表明苏木酮A可以直接抑制代谢功能障碍环境下的肝细胞中的脂肪生成。

9、苏木酮A通过Mup3抑制PA诱导的AML12小鼠肝细胞脂肪生成

为了探索苏木酮A调节MASH肝脏中脂肪分解的机制，进行了转录组测序分析。筛选出NC与MCD组以及MCD与MCD + 苏木酮A组之间差异最显著的前20个重叠的DEGs。有趣的是，载脂蛋白Mup3的表达水平在MASH肝脏中显著降低，而苏木酮A治疗恢复了这一变化（图9A）。Western blot也揭示了相同的模式（图9B和C）。我们进一步检查了锌指和同源盒2（Zhx2）的表达水平，Zhx2是Mup3的关键调节因子（Jiang等，2017），发现经苏木酮A治疗的MCD处理组中Zhx2表达增加（图9D），这与Mup3的表达一致，进一步证实了Mup3信号通路。此外，PA降低的Mup3表达在肝细胞中部分被苏木酮A治疗逆转（图9E）。根据这些观察，我们推测苏木酮A的抗脂肪肝效应可能是通过靶向Mup3实现的。

为了验证上述推测，我们使用siRNA沉默AML12肝细胞中Mup3的表达。干扰效率如图9F所示，敲低效率超过60%。值得注意的是，Mup3敲低部分消除了苏木酮A提供的脂肪分解效应，这通过脂肪生成基因水平的增加（图9G）以及TG和TC（图9H）得到证实。此外，Bodipy荧光染色表明，沉默Mup3增加了脂质含量，并减少了苏木酮A对肝细胞脂质形成的影响（图9I - J）。综上所述，这些结果表明Mup3对于苏木酮A诱导的肝细胞中脂质积累的抑制是必不可少的。

【结论】

MASH的肝脏表现包括代谢功能障碍和肝脏病理之间的复杂相互作用，涉及肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。在本研究中，数据显示了MASH小鼠明显的肝脏并发症，包括肝脏脂肪变性和脂肪生成（图4和5）、肝脏纤维化（图6）和炎症（图7），这表明成功构建了MASH小鼠模型。然而，针对MASH最有效的药物疗法仍然难以捉摸。吡格列酮是APASL推荐的特定疗法之一，改善了MASH患者的肝脏组织病理学，包括肝脏脂肪变性、气球样坏死和炎症。因此，针对进展性MASH的治疗药物开发存在未满足的医疗需求。

我们发现苏木酮A治疗减轻了MASH模型中的这些肝脏并发症（图4-7）。水飞蓟素已被证明可以阻碍MASH的进展。高剂量苏木酮A治疗表现出与水飞蓟素相似的效果（图2、4和6），这表明苏木酮A具有作为MASH治疗选择的潜力。在本研究中，我们发现苏木酮A有效地限制了肝细胞中的脂质积累和脂毒性，至少部分是通过靶向Mup3，从而抑制小鼠中MASH的发展。本研究的新颖之处在于探索了苏木酮A及其在MASH小鼠模型中可能的机制，为寻找有效的治疗药物提供了新的见解。

肝细胞负责肝脏的主要代谢功能。为了为这些生理活动提供能量，肝细胞吸收和利用大量的脂质，包括游离脂肪酸和脂蛋白残余物。肝细胞是肝脏中储存甘油三酯的主要细胞，也是MASLD中积累脂质的细胞。在MASLD患者中，脂质的摄取和合成超过了通过消耗和排泄的通量，导致肝细胞中脂质过度沉积，最终诱导细胞脂毒性。脂毒性是MASLD和MASH的主要因素之一，其特征是在肝细胞的细胞质中积累有毒脂质，导致细胞器功能障碍、细胞损伤，最终导致脂肪细胞凋亡。

Mups作为一种脂质载体蛋白超家族，被认为在运输亲脂性分子和调节细胞稳态方面具有双重分子功能。值得注意的是，Mups在介导这些脂质分子的运输中起着重要作用。研究表明，用重组Mup1治疗雄性糖尿病小鼠可降低血清甘油三酯和胰岛素水平，并减少骨骼肌中的脂质积累。一致地，AM251，一种CB1R拮抗剂，通过在肝细胞中产生Mup1，减轻了游离脂肪酸诱导的胰岛素信号磷酸化的损伤。值得注意的是，包括Mup3在内的几种Mups在MASLD小鼠的血清和肝脏组织中减少，而Mups补充显著减轻了疾病条件下的内质网应激和胰岛素抵抗。从我们的发现中注意到，敲低肝细胞中Mup3的表达显著加剧了脂质沉积。Zhx2被发现是Mup3的关键调节因子，我们验证了在MASH小鼠模型中，苏木酮A治疗后Zhx2的表达增加。这一观察与Mup3的表达水平一致，进一步证实了Mup3信号在介导苏木酮A的肝保护中的作用。

包括肝细胞脂毒性、氧化应激、胰岛素抵抗和肠道菌群失调在内的众多因素促成了肝脏炎症反应。肝脏巨噬细胞，包括浸润的单核细胞衍生巨噬细胞和驻留的库普弗细胞（KCs），已被确定在MASH的炎症过程中发挥关键作用。巨噬细胞极化是影响MASH进展的关键因素，M1和M2代表巨噬细胞的两种极化状态，分别通过促炎和抗炎活性在体内维持稳态。MASH患者促炎细胞因子和趋化因子水平升高。TNFα、IL - 1β和IL - 6等促炎细胞因子在MASH的背景下发挥多种作用。这些细胞因子的分泌延长了免疫反应，并促进了中性粒细胞和巨噬细胞向损伤部位的补充。这一过程加剧了炎症反应，并形成了恶性循环。此外，某些细胞因子诱导HSCs分化成产生大量细胞外基质的肌成纤维细胞，最终导致纤维化。此外，这些细胞因子在放大脂肪组织内的炎症级联反应中起着关键作用，从而导致胰岛素抵抗并促进脂质积累。趋化因子，包括CCL2和CXCL10，在MASH中加剧炎症和纤维化，并促进免疫细胞的肝脏浸润。

我们团队之前的研究发现苏木酮A可以抑制急性肝损伤中的肝脏炎症和肝纤维化。在本实验中，我们首次证实苏木酮A减轻了受损小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润，并抑制了M1型巨噬细胞的极化。此外，受损小鼠肝脏中肝脏TNFα、IL - 1β和IL - 6的表达升高。MASH小鼠肝脏中CCL2和CXCL10的表达表现出相同的趋势。值得注意的是，苏木酮A降低了MASH小鼠中这些肝脏炎症因子。然而，苏木酮A在MASH中的抗炎作用尚未研究，这构成了本研究的局限性。因此，需要进一步的研究来更清晰地阐明苏木酮A在KCs中与MASH相关的肝脏炎症中的作用。

在本研究中，我们证明了苏木酮A至少部分通过上调肝细胞中Mup3的表达来减轻MASH。然而，转录组测序中受苏木酮A影响的前20个重叠基因，包括Semaphorin 3b（Sema3B）、GIPC PDZ结构域含家族成员2（Gipc2）以及CD63，可能在MASH进展中发挥作用。最近的一项研究发现，Sema3B通过促进M2 - 巨噬细胞极化减少促炎细胞因子的分泌，在骨关节炎模型中发挥作用。相反，先前的一项研究报告称Sema3B可以促进IL - 18的产生并增加肿瘤微环境中M1 - 巨噬细胞的募集。已有文献记载Gipc2参与肿瘤细胞凋亡和免疫细胞浸润。CD63，也称为溶酶体相关膜蛋白3。CD63敲低抑制了RAB37介导的人脂肪源性间充质干细胞的脂肪生成分化。除了介导脂肪生成外，CD63还能够调节凋亡。抑制CD63的表达阻断了人肾小管上皮细胞的细胞凋亡。由于这些结果表明这三个基因参与了MASH的进展，我们进一步验证了Sema3B、Gipc2和CD63的基因表达在MASH模型中显著上调，但在苏木酮A给药后降低。然而，这三个基因作用的具体机制尚未探索，这代表了本研究的局限性。因此，后续研究应进行以探索Sema3B、Gipc2和CD63在MASH发病机制中的具体作用。此外，MAPK信号通路被PharmMapper服务器预测为苏木酮A的潜在靶向通路。我们的数据还显示MAPK通路在MASH小鼠肝脏中被激活，而苏木酮A治疗改变了这一趋势，表明苏木酮A提供的肝保护可能部分通过调节MAPK信号通路实现。

总之，我们的数据描绘了苏木酮A作为MASH保护剂的潜在功能。如图9K所示，苏木酮A通过上调肝细胞中Mup3的表达抑制脂质沉积，从而减少脂毒性、肝脏炎症和纤维化，这导致了MASH进展的减轻。因此，苏木酮A有潜力成为MASH的新型治疗剂。

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