维生素K（VK） 是一种不可或缺的脂溶性维生素。在人体内，内质网膜蛋白γ-谷氨酰羧化酶（γ-glutamyl carboxylase,GGCX） 是唯一已知的利用VK作为辅因子 （co-factor） 的酶。GGCX可以通过氧化VKH2 （还原态的VK） ，将VK依赖蛋白 （VK-dependent proteins，VDPs） 中特定的谷氨酸 （Glu） 残基羧基化，使其变成γ-羧基谷氨酸 （Gla） 。目前已知的VDPs包括凝血因子II、VII、IX、X、骨钙素 （Osteocalcin，也称为Bone Gla Protein，BGP） 、基质Gla蛋白 （Matrix Gla protein，MGP） 、生长停滞特异性蛋白6 （Growth arrest-specific 6，Gas6） 等，它们参与凝血、骨骼形成、组织钙化、生长发育等多种生物学过程。由于羧基化对VDPs的功能至关重要，VK缺乏或者GGCX突变则会导致与VDPs相关的疾病，然而GGCX利用VK完成VDP羧基化的分子机理依然不清楚。
2025年1月29日，德克萨斯大学西南医学中心 （UT Southwestern Medical Center） 的齐晓峰实验室在Nature发表了题为Structure and mechanism of vitamin-K-dependent γ-glutamyl carboxylase的研究论文。该工作解析了GGCX处于不同状态的冷冻电镜结构，揭示了GGCX的催化机理，并且发现了胆固醇（Cholesterol）对GGCX的关键调节作用。
VDPs的N端含有一个“前肽 （Propeptide） ”片段，它可以引导VK依赖蛋白结合GGCX并且具有激活GGCX的功能。为了揭示Propeptide激活GGCX的机理，作者比对了GGCX在apo和BGP结合状态下的结构，Propeptide结合在GGCX内质网腔结构域的两个亚结构域之间，该结合引发了GGCX内质网腔结构域的构象变化，使其结合并稳定了跨膜螺旋TM6和TM7。稳定后的TM6和TM7和TM5，TM8一起形成了一个底物结合口袋，该口袋开口朝向内质网膜。由于VK是一个脂溶性分子，作者推断该口袋可能是VK结合位点。为验证猜想，作者在表达GGCX-BGP复合物时加入MK-4 （维生素K2亚家族成员） ，并解析了GGCX-BGP-MK-4的复合物结构。不出所料，VK结合在TM6和TM7形成的口袋中。这一发现揭示了Propeptide激活GGCX的机理，即Propeptide结合稳定了GGCX并使其形成VK结合口袋，而没有Propeptide结合的情况下，GGCX无法结合VK。随后，作者分析了位于GGCX内质网腔结构域底部的催化中心。BGP的Glu残基从内质网腔结合到催化中心，而VK从内质网膜进入催化中心。GGCX中His160、Ile296、Phe299、Met401和Met402等残基在结合Glu和VK中发挥重要作用，而Lys218残基则负责VKH2去质子化，促使羧化反应的发生。
有意思的是，GGCX的跨膜区特异结合了一个胆固醇分子。为了研究胆固醇对GGCX的调节作用，作者使用了UT-2细胞系，该细胞因缺乏胆固醇合成通路里的关键限速酶HMG-辅酶A还原酶 （HMG CoA Reductase，HMGCR） 而无法合成胆固醇。通过调节细胞培养基中胆固醇的含量，作者成功在UT-2细胞的内质网上建立了可控的胆固醇浓度梯度。利用该实验体系，作者发现GGCX蛋白水平随着胆固醇的浓度呈显著正相关。进一步的分子动力学模拟实验 （MD simulation） 显示胆固醇分子可以提高GGCX结构的稳定性。这些结果证明了胆固醇通过稳定GGCX结构来调节其在细胞中的蛋白水平。
结合作者之前HMGCR和UBIAD1 （UbiA prenyltransferase domain containing 1） 相关的研究工作，作者提出了GGCX的催化和调节模型：新合成的GGCX蛋白在胆固醇的帮助下完成跨膜区的正确折叠，VDPs的结合则进一步稳定GGCX，促使VK结合口袋的形成，随后VK从内质网膜进入结合口袋，在氧气和二氧化碳的参与下，羧化反应发生。其中UBIAD1具有双重功能，它既可以阻止HMGCR降解从而促进胆固醇合成，又可以把VK1转化成VK2调节VK在不同组织中的分布。此项工作将胆固醇和VK两个重要分子联系在一起，而胆固醇和VK两个分子之间的关联与互作值得进一步的研究。
德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系 （Molecular Biology） 助理教授齐晓峰博士为本文的通讯作者，分子遗传学系 （Molecular Genetics） 博士后王嵘为本文的第一作者。分子遗传学系Michael Brown教授和Joseph Goldstein教授 （两人同为1985年诺贝尔生理与医学奖得主） ，以及李晓淳教授 （齐晓峰博士的博士后导师） 为该研究提供了宝贵意见和大力支持。
值得一提的是，同期Nature发表了来自华盛顿大学题为Molecular basis of vitamin K driven γ-carboxylation at membrane interface的类似工作。
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08484-9
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