探索高原大棚越冬结球甘蓝游离小孢子培养新方法

探索高原大棚越冬结球甘蓝游离小孢子培养新方法

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23-G07）；河北省现代农业产业技术体系建设专项（HBCT2024140201，HBCT2024140203）

康少辉等

结球甘蓝为一年生至二年生的十字花科芸薹属植物，具有显著的杂交优势。传统育种方式主要是自交不亲和系制种和雄性不育系制种 ，利用甘蓝杂交优势培育杂种 1 代。自交不亲和系制种的优势在于操作简便，杂种 1 代种子产量较高，可以同时进行正反交。但因花期自交时出现严重结实不良现象，需人工蕾期自交授粉，导致人工成本高，杂种 1代种子纯度低，而且需要多年连续自交，育种年限长；雄性不育系制种是一种重要的制种方法，其优势在于可以免去人工去雄 ，从而减少生产成本，第一代杂交种子具有更高的纯度，但其不足之处在于保持系的选育和雄性不育系的培育比较困难。

游离小孢子育种通过游离小孢子在离体条件下进行培养，通过胚状体或愈伤组织的诱导，再生出完整的单倍体植株，完全的单倍体细胞得以再生，而后经过诱导使染色体加倍 ，成为正常可育DH 系。该技术可得到纯合的二倍体，消除了显隐性基因的影响，获得遗传性状稳定的种质，缩短育种年限 4~5 a （年）（图 1）。该技术是一种快速获取纯系、用于作物遗传改良的一种重要方法。

图 1 传统育种与游离小孢子培养技术路线

1982 年，Lichter 利用游离小孢子培养法，首次成功地得到了油菜游离小孢子植株，在此基础上，以芥菜、大白菜、白菜、甘蓝和芜菁等为材料，对其进行了游离小孢子培养，并获得了再生植株。现已在杂优亲本培育、常规育种、遗传群体构建和转基因等研究中广泛应用。甘蓝游离小孢子培养普遍存在出胚难、出胚率低等现象，探索提高甘蓝出胚率的途径也就成为本次研究的重点。由于高原地区冬季温度低，甘蓝露地越冬育种会出现冻死、冻伤的现象，成活率低，采用大棚栽培方式可以随时控温，使甘蓝能够很好地进行春化、抽薹、结籽。笔者团队从 2017 年研究探索，初步建立了高原大棚越冬结球甘蓝游离小孢子培养技术体系，利用该技术先后选育的张甘 40、张甘 60 和张甘 65 等系列品种，居国际先进水平，在全国广泛推广应用，现将该技术总结如下。

1 材 料

1.1 播种

8 月中旬在温室大棚穴盘育苗，选择 72 穴育苗盘，通常情况下，育苗基质一般选用草炭、蛭石、珍珠岩的配比（体积比）为 8∶1∶1，每穴 1 粒，再用蛭石覆土 ，浇透水，苗期常规管理。

1.2 整地规划

大棚内起垄栽培，铺设滴灌带，垄沟 70 cm，垄高 20 cm，垄面 30 cm。

1.3 定植

9 月中旬，小苗长到 5~6 片真叶时开始定植，每垄定植 1 行，株距 50~60 cm，标明号码牌，定植后浇定植水，后期田间常规管理，田间见干见湿，预防病虫害。

1.4 春化

1 月初大棚内开始降温，白天将棉帘拉开一半，使温度保持在 0~10 ℃，晚上关闭棉帘。低温春化时间为 30~40 d，2 月中旬白天将棉帘全部拉开，开始升温，使温度维持在 20~25 ℃。

1.5 划十字

春化结束后，在球顶部用小刀划十字，深度以不伤害生长点、长度以外皮宜崩开为宜。

2 实验室准备

2.1 超净工作台灭菌

超净工作台用 75%乙醇擦拭后，在紫外灯下灭菌 30 min，再进行 30 min 通风。

2.2 灭菌

B5 洗液：分装到三角瓶中，每瓶 30~40 mL，用双层透气封口膜密封好，标明号码，120 ℃高压灭菌 25 min，灭菌完成后，保存，避免粉尘污染。

NLN 培养液：首先用 0.45 μm 微孔滤膜抽滤 1次、0.22 μm 微孔滤膜抽滤 2 次，在超净工作台上用0.22 μm 微孔滤膜抽滤 1 次，分装到三角瓶中，每瓶30~40 mL，用双层透气封口膜密封好，标明号码，保存，避免粉尘污染。

超纯水：分装到带盖的 500 mL 玻璃瓶中，每瓶150~200 mL，盖子不要盖太紧，120 ℃高压灭菌25 min，灭菌完成后将盖子盖紧，标明号码，保存，避免粉尘污染。

3 选 蕾

因品种而异，一般 3 月初进入初花期，选择在09：00—10：00 采蕾，晴天或阴雨天皆可（郭世星等 、孙继峰 研究报道低温有利于游离小孢子的胚胎发生）。选取主枝或生长状态较好的 1 级侧枝花蕾（图 2），大小在 4.50~5.49 mm 之间 ，装入培养皿中，标明号码，放置在盛有冰袋的保温箱中。因不同的甘蓝品种花蕾的发育时期不同，可利用显微镜（25×）、坐标纸选取单核靠边期的花蕾（图 3）。选蕾完成后（20 蕾左右）标明号码，倒入 60 目铁丝网中，封口，放置于湿润的条件下低温保存（4 ℃冰箱）1~2 h，有利于出胚。

图 2 主枝或生长状态较好的 1 级侧枝花蕾

图 3 单核靠边期的花蕾

4 花蕾消毒

将所选择的花蕾置于一个三角形的玻璃瓶中，以 75%乙醇进行 1 min 的灭菌，再用 0.1%的升汞进行 8~10 min 的灭菌，最后用超纯水摇晃清洗 3 次，每次 1 min。

5 抽提小孢子

将花蕾放置于玻璃管中，加入 5~7 mL B5 洗液，用玻璃棒研磨使小孢子散出，通过双尼龙网过滤器将小孢子滤液注入 10 mL 离心管内。用移液枪吸 B5 洗液冲洗过滤器中的小孢子，冲 2~3 次后，使 10 mL 离心管中小孢子悬浮液稀释，盖盖，用Parafilm 膜封口，标明名称。

6 离 心

将小孢子悬浮液 用离心机 2000 r·min -1 离心5 min ，将离心管中的上层清液倒出，再加 10 mL B5洗液，盖盖，用 Parafilm 膜封口。摇晃离心管将沉淀的小孢子冲散，再次将悬浮 用离心机 2000 r·min -1离心 5 min ，倒出上层清液，再加 10 mL B5 洗液，盖盖 ，用 Parafilm 膜封口。摇晃离心管将小孢子 沉 淀 物（图 4）冲散，再次将悬浮液 用离心机2000 r·min -1 离心 5 min， 倒出上层清液。

图 4 小孢子沉淀物

7 出胚培养

7.1 热激培养

将沉淀的小孢子用 NLN-17 [12-13] 培养液稀释至淡黄色，用移液枪吸取 3 mL 分装到 60 mm 的培养皿中，在培养皿中再注入 5 mL NLN-17 培养液，用Parafilm 膜封口，标明名称和时间。把分装好的培养皿放置在 32 ℃恒温培养箱中暗培养 2~3 d（48~72 h 之间）。

7.2 置换培养

热激后检查培养皿中是否有出现污染情况，如果没有污染，就利用倒置显微镜（10×）挑选出大部分膨大的游离小孢子（图 5）培养皿做置换。用移液枪把悬浮培养液吸入离心管中离心， 用离心机2000 r·min -1 离心 5 min ，倒掉 NLN-17 悬浮液体，留下沉淀的小孢子。用 NLN-14 培养液稀释沉淀的小孢子，并将其分装入 90 mm 培养皿中，一般每皿加入悬浮液 5 mL 左右，再注入 5 mL NLN-14 培养液，用 Parafilm 膜封口，标明名称、时间 。

图 5 膨大的游离小孢子

7.3 静止培养

将封口的培养皿放置在 25 ℃的恒温培养箱中进行暗培养，大约 15 d 后，观察有无明显的白色颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的小白点状胚出现，则改为振荡培养。

7.4 振荡培养

将出现有一定数量小白点状胚状体（图 6）的培养皿放入 60 r·min -1 25 ℃恒温摇床 上继续进行暗培养。

图 6 小白点状胚状体

8 胚状体成苗培养

8.1 诱导培养

当暗培养的胚发育至子叶形胚时移入 B5固 体 培 养 基（B5 + Suc30 g·L -1 +Agar 10 g·L -1 +GA 3 0.1 mg · L - 1 ）上，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗2000 lx 光强条件下培养，进行再生苗的诱导直至出现不定芽（图 7）。

图 7 分离出的不定芽

8.2 继代培养

不定芽长有 2~3 片小叶时，切下不定芽，转接到固体培养基（MS+ Suc 30 g· L -1 +Agar 10 g· L -1 +6-Ba0.15mg·L -1 ）中，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx光强条件下培养（图 8）。

图 8 植株不定芽培养

8.3 生根培养

当 长 到 3~4 片 真 叶 时 ，转 接 到 固体培养基（ MS+ Suc 30 g · L - 1 +Agar10 g · L - 1 +NAA0.1 mg · L -1 ）中，在 25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx 光强条件下进行生根培养（图 9）。

图 9 植株生根培养

9 植株移栽

当获得的植株长有 5~6 片真叶时，打开封口膜炼苗（图 10）2~3 d 后，从试管中取出，洗净根系（一定要清洗干净，否则后期会有污染），移栽到花盆中，3~4 d 后连盆带苗端到温室中（图 11），3~4 d 后定植到温室里，后期常规管理，培养成株。

图 10 植株炼苗

图 11 田间定植苗

10 倍性鉴定

由于小孢子培养出的植株是单倍体，育性差，不能正常结籽，在育种中往往不能被直接利用，必须诱导进行加倍（将含有 0.2%秋水仙碱水溶液的棉球置于单倍体植物的顶端分生组织和次生组织部位，诱导分生组织细胞染色体加倍）处理，使之成为双单倍体（DH）植株。但通过诱导加倍的群体通常是单倍体、二倍体和多倍体组成的混合群体。通过倍性鉴定可快速获得可用于遗传和育种研究的大量二倍体植株。

利用流式细胞仪 可迅速准确地鉴定甘蓝成株材料是否为二倍体，这种检测不受植物取材部位和时间限制。

10.1 溶液配制

溶液Ⅰ：将 4.2 g 浓度为 0.1 mol·L -1 的柠檬酸和1 mL 的 0.5%的吐温 20 混合，将其定容至 200 mL，在 4 ℃下保存备用。

溶液Ⅱ：将 28.65 g 浓度为 0.4 mol·L -1 的磷酸氢二钠、碘化丙啶 20 mg 定容至 200 mL，在室温下保存备用。

10.2 材料处理与检测

选取组培苗嫩叶 1 cm 2 ，放入裂解液中（200 μL溶液Ⅰ和 600 μL 溶液Ⅱ），用锋利的双面刀片切碎叶片，静置 5 min 使其裂解，经过尼龙筛网过滤，将所得滤液在离心机上 1000 r·min -1 离心 6 min，倒掉上清液。加入碘化丙啶染色剂，混匀，4 ℃避光静置15 min 后，取液体加入流式细胞仪内进行检测。以普通甘蓝二倍体植株作对照，分离峰出现在荧光强度 200 处即为二倍体。