线粒体是连接氧化应激和成骨细胞死亡的关键环节。线粒体不仅负责产生ROS（氧化应激的重要贡献者），还具有内在的抗氧化系统来平衡ROS和维持细胞氧化还原平衡。然而，长期暴露于氧化应激会损害线粒体稳态，损害其维持充分抗氧化防御的能力。因此，ROS的过度释放进一步放大了细胞氧化应激，建立了一个有害的循环。此外，线粒体在调节细胞死亡信号通路和蛋白表达方面发挥着至关重要的作用，使线粒体损伤能够激活多种细胞死亡途径，如线粒体自噬和铁死亡。几项研究探讨了gcs诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和随后的成骨细胞死亡之间的关系。这些研究探讨了GCs如何诱导氧化应激，导致线粒体损伤并最终导致成骨细胞死亡。因此，靶向线粒体可能是减轻gcs诱导的氧化应激触发的成骨细胞死亡的关键。

2025年1月26日，广州中医药大学陈镇秋/何伟团队在Bone Res（IF=14.3,医学1区）上在线发表题为“ Isovitexin targets SIRT3 to prevent steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by modulating mitophagy-mediated ferroptosis ”的文章，揭示了异牡荆素对激素性股骨头坏死的影响和分子机制，Isovitexin通过促进SIRT3的表达，有效地调节线粒体自噬，维持成骨细胞中的线粒体稳态，抑制铁死亡，恢复成骨能力。

摘要

糖皮质激素（glucocorticoid， GC）介导的氧化应激诱导的成骨细胞死亡在激素性股骨头坏死（steroid-induced osteonecrosis of The femoral head， SIONFH）的发生发展中起着至关重要的作用。由成骨细胞驱动的骨形成改善在SIONFH的预后中显示出良好的结果。异牡荆素已被证明具有抗氧化特性，但其对gc诱导的氧化应激和SIONFH的治疗作用尚不清楚。在这项研究中，我们使用蛋白质组学和生物信息学方法分析了从SIONFH患者获得的临床样本。我们发现线粒体稳态失衡和铁死亡诱导的成骨能力受损在SIONFH中。随后，我们研究了线粒体与铁死亡之间的因果关系，以及线粒体自噬在维持线粒体稳态和控制铁死亡中的调控作用。然后，我们确定了SIRT3在调节线粒体稳态和铁死亡中的关键作用。此外，分子对接和免疫共沉淀证实SIRT3和BNIP3之间存在强相互作用。值得注意的是，恢复SIRT3表达显著抑制了BNIP3/NIX通路介导的病理性线粒体自噬。此外，我们发现Isovitexin通过促进SIRT3的表达，有效地调节线粒体自噬，维持成骨细胞中的线粒体稳态，抑制铁死亡，恢复成骨能力，从而显著改善SIONFH。这些发现揭示了异牡荆素对SIONFH的作用和分子机制，并强调靶向SIRT3作为抑制成骨细胞线粒体自噬介导的铁死亡和抗SIONFH的潜在策略。

1.线粒体稳态的破坏和铁死亡诱导的成骨能力的损伤在SIONFH中存在

为了研究股骨头坏死的潜在机制，我们对股骨头坏死区域和健康区域的骨片进行了蛋白质组学分析。对所得数据进行全面的生物信息学分析。首先，我们进行了差异蛋白质分析，以确定上调或下调的蛋白质（图1a）。随后进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析发现线粒体和氧化应激相关的生物过程显著参与（图1b）。在KEGG富集分析中，铁死亡通路因其与氧化应激和线粒体的复杂关联而受到特别关注（图1c）。

为了验证这些发现，我们进行了体内和体外实验。在体内实验中，我们建立了大鼠SIONFH模型来验证观察结果，而在体外实验中，我们使用MC3T3-E1细胞干预GCs对成骨细胞的作用。大鼠股骨头IF染色显示ROS水平显著增加，线粒体自噬相关标志物BNIP3/NIX病理性升高（图1d， e）。在MC3T3-E1细胞中DEX干预后，观察到ATP释放减少（图1f）和MMP丢失（图1g），表明线粒体损伤。TEM进一步证实了DEX干预后MC3T3-E1细胞线粒体中存在线粒体自噬（图1h）。流式细胞术分析显示，DEX处理后，ROS水平升高，通过平均荧光强度（MFI）测量（图1i）。此外，通过IF分析（图1j）和WB分析（图1k）检测线粒体自噬（BNIP3/NIX）、分裂（DRP1）和融合（MFN1/MFN2）的标志物。结果表明，线粒体自噬和分裂增强，而线粒体融合减少。

图1 在SIONFH中线粒体稳态被破坏

我们已经将后续与线粒体自噬相关的实验的重点转移到BNIP3/NIX通路。此外，免疫组织化学染色显示，在SIONFH大鼠股骨头中GPX4的表达显著降低（图2a）。体外WB（图2b）、IF染色（图2c）、MDA水平、Fe2+水平和GSH水平的测定（图2d）进一步证实了铁死亡的存在。最后，OCN的IHC染色表明，在SIONFH大鼠的股骨头内，成骨能力减弱（图2e）。包括qRT-PCR（图S1G）、WB分析（图2f）和ALP染色（图2g）在内的体外实验为成骨能力下降提供了额外的支持。

图2 在SIONFH中存在铁死亡诱导的成骨能力受损

2.恢复线粒体稳态可以挽救MC3T3-E1细胞的成骨能力，防止铁死亡

首先，确定XJB-5-131的合适干预浓度，将细胞分为3组：对照组、地塞米松组、地塞米松+ XJB-5-131组。采用CCK-8法评估XJB-5-131对MC3T3-E1细胞的毒性（图3a），确定干预浓度为800 nmol/L。我们最初的重点是XJB-5-131对线粒体稳态的修复作用。通过JC-1染色（图3b）、ROS的流式细胞术分析（图3f），我们观察到XJB-5-131干预导致MC3T3-E1细胞中MMP恢复、ATP释放增加和ROS水平降低。此外，我们使用TEM检查线粒体形态（图3c），并使用WB（图3d）和IF染色（图3e）对线粒体自噬、分裂和融合标志物进行定量分析。结果表明，与DEX组相比，XJB-5-131处理减少了线粒体自噬和分裂，同时促进了线粒体融合。为了验证恢复线粒体稳态是否会抑制铁死亡，我们进行了IF染色（图3g）和WB分析（图3h），并测定了MDA、Fe2+和还原性GSH的水平（图3I）。这些测量和分析表明，线粒体调控在铁死亡的发生中起着至关重要的作用。最后，我们通过ALP染色（图3j）、WB（图3k）检测了XJB-5-131对成骨分化的修复作用。结果显示，与DEX组相比，DEX + XJB-5-131组的成骨能力得到了恢复。

图3 恢复线粒体稳态可以挽救MC3T3-E1细胞的成骨能力，防止铁死亡

3.线粒体自噬在维持MC3T3-E1细胞线粒体稳态中起关键作用

通过CCK-8实验确定Mdivi-1的安全浓度后，我们选择5 μmol/L作为干预浓度（图4a）。首先，使用TEM（图4b），我们观察到Mdivi-1干预后dex诱导的线粒体自噬被抑制。WB（图4d）和IF染色（图4e）结果也表明，与DEX组相比，线粒体自噬受到抑制，线粒体分裂减少，线粒体融合增加。MMP恢复（图4c）和ROS水平降低（图4f）进一步证实了线粒体自噬在调节线粒体稳态中的关键作用。随后，我们验证了Mdivi-1对铁死亡的抑制作用。WB分析（图4g）和IF染色（图4h），以及MDA、Fe2+和GSH水平的测定（图4i）表明，铁死亡的发生从根本上受到线粒体自噬的调节。最后，我们通过ALP染色（图4j）、WB（图4k）检测了Mdivi-1对成骨分化的修复作用。结果显示，与DEX组相比，DEX+Mdivi-1组的成骨能力有所恢复。这些发现表明铁死亡的发生依赖于线粒体自噬，而线粒体自噬在维持线粒体稳定性中起着至关重要的作用。抑制过度线粒体自噬可保护MC3T3-E1细胞免于铁死亡，恢复其促进骨形成的能力。

图4 线粒体自噬在维持MC3T3-E1细胞线粒体稳态中起关键作用

4.SIRT3通过调控线粒体自噬发挥其调控作用

我们首先从公共数据中选择铁死亡和线粒体相关蛋白，将其与从SIONFH患者骨片中获得的差异表达蛋白取交集，共得到45个蛋白，均来源于患者样本。最后，我们通过三种机器学习技术确定了关键蛋白SIRT3（图5a）。蛋白质组学分析发现SIRT3表达下调，WB（图5b）和IF染色分析（图5c）进一步证实了GCs干预后SIRT3表达下调。鉴于线粒体自噬在维持线粒体稳态中的重要作用，我们假设SIRT3可能通过调节线粒体自噬发挥其作用。为了研究这一点，我们在SIRT3和BNIP3之间进行了分子对接，发现这两个蛋白之间有很强的结合亲和力（图5d）。随后，我们进行Co-IP实验进一步证实SIRT3与BNIP3的相互作用（图5e）。由于DEX治疗导致SIRT3表达的抑制，我们的目的是通过使用SIRT3激动剂来验证我们的假设。

图5 SIRT3通过调控线粒体自噬发挥其调控作用

通过前期实验确定SIRT3激动剂的安全浓度后，我们以800 μmol/L的浓度进行实验（图5f）。首先，我们使用TEM（图5g）、IF染色（图5h）和WB（图5i）验证了SIRT3激动剂对线粒体自噬的调节。结果表明，SIRT3激动剂增加SIRT3表达，抑制线粒体自噬和线粒体分裂，促进线粒体融合。ROS的流式细胞术分析（图5j）和JC-1染色（图5k）表明，SIRT3激动剂修复了dex诱导的线粒体功能损伤。随后，我们验证了SIRT3激动剂对铁死亡的抑制作用（图6a-c）及其在恢复成骨分化中的作用（图6d、e）。综上所述，这些实验结果支持SIRT3通过调节线粒体自噬恢复线粒体稳态，从而抑制MC3T3-E1细胞铁死亡，促进成骨分化的结论

图6 SIRT3通过调控线粒体自噬抑制铁死亡，恢复成骨能力

5.异牡荆素通过上调SIRT3恢复gcs诱导的线粒体损伤

在体外实验的最后一步，我们对Isovitexin和SIRT3进行了分子对接（图7a），并进行了网络药理学分析，以研究Isovitexin和SIONFH之间的关联。结果表明，异牡荆素不仅表现出与SIRT3的强结合亲和力（- 8.1 kcal/mol），而且主要靶向与SIONFH相关的氧化应激和线粒体。我们确定Isovitexin的安全浓度为150 μmol/L，并继续验证其对SIRT3的调节作用。通过IF染色（图7b）、WB（图7c）和TEM（图7d），我们证实了Isovitexin通过激活SIRT3增加SIRT3的表达，促进线粒体融合，抑制线粒体自噬和分裂。JC-1染色（图7e）和ROS的流式细胞术分析（图7f）进行的进一步评估阐明了Isovitexin对线粒体功能的恢复作用。与之前的实验类似，我们也证实了Isovitexin对铁死亡的抑制作用（图7g， h）以及其恢复成骨分化的能力（图7i， j）。这部分实验的结果证实了Isovitexin通过上调SIRT3来恢复gcs诱导的线粒体损伤并预防MC3T3-E1细胞的铁死亡。异牡荆素激活SIRT3，促进线粒体融合，抑制线粒体自噬和分裂，恢复线粒体功能。

图7 异牡荆素通过上调SIRT3恢复gcs诱导的线粒体损伤

6.异牡荆素靶向SIRT3通过调控线粒体自噬介导的铁死亡来预防SIONFH

首先进行HE染色评估模型诱导成功；结果显示实验组空骨陷窝增多，表明存在SIONFH。然而，药物组显示出较低的空陷窝，表明药物对SIONFH大鼠的治疗效果（图8a）。Micro CT结果显示BV/TV、Tb。N和Tb。实验组的Th值最低，而药物组的上述指标均有明显改善。另一方面，Tb。药物组的Sp高于实验组，与预期结果一致（图8b， c）。接下来，使用IHC染色（图8d， e）和WB（图8f）分析各组成骨标志物的表达。结果显示，虽然在药物组中RUNX2和OCN的表达没有对照组高，但与实验组相比，它们显著增加。

图8 异牡荆素通过促进成骨来对抗SIONFH

此外，为了验证体外实验中提到的机制，我们检测了线粒体相关指标。IF染色显示，所有4个药物组的ROS表达均降低（图9a）。进一步的IF染色和WB分析结果显示，与实验组相比，SIRT3在XJB-5-131和Mdivi-1组中表达没有变化，而在SIRT3激动剂和Isovitexin组中表达增加，这与体外实验的结果一致（图9a， b）。IF染色和WB分析还检测了关键标志物如BNIP3， NIX, MFN1， MFN2和DRP1的表达。结果表明，实验组线粒体自噬和分裂增强，而融合减少。然而，四个药物组能够逆转这一情况，并恢复线粒体稳态（图9a， b）。最后观察铁死亡相关指标。IHC染色（图9c、d）、MDA检测（图9e）、GSH检测（图9f）、WB分析（图9g）结果显示，实验组发生了明显的铁死亡，而药物组有效抑制了铁死亡。

综上所述，基于这部分动物实验，我们最终可以得出结论，Isovitexin靶向SIRT3通过调控线粒体自噬抑制成骨细胞铁死亡来预防SIONFH。结果支持异牡荆苷预防SIONFH的潜力。

图9 异牡荆素靶向SIRT3通过调控线粒体自噬介导的铁死亡来预防SIONFH

结论

综上所述，我们的研究表明，异牡荆素对SIONFH的作用依赖于SIRT3。总之，异牡荆素上调SIRT3，抑制过度线粒体自噬，恢复GCs诱导的氧化应激导致的线粒体稳态失衡，从而减少成骨细胞的铁死亡。综上所述，我们的研究揭示了SIRT3在调节线粒体自噬和维持线粒体稳态中的重要作用。此外，我们的发现强调了靶向SIRT3抑制成骨细胞线粒体自噬介导的铁死亡以对抗SIONFH的前景。

Fan Y, Chen Z, Wang H, Jiang M, Lu H, Wei Y, Hu Y, Mo L, Liu Y, Zhou C, He W, Chen Z. Isovitexin targets SIRT3 to prevent steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by modulating mitophagy-mediated ferroptosis. Bone Res. 2025 Jan 26;13(1):18. doi: 10.1038/s41413-024-00390-0.

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