撰文 | 染色体

核孔复合体（NPCs）是跨越核膜的大型蛋白通道，负责细胞质与细胞核之间的大分子运输。它们由约30种核孔蛋白（Nups）组成，并能与基因组相互作用，调控转录、DNA修复等过程【1】。在酵母中，一些可诱导基因在激活后会定位至核膜并结合Nups，这一过程依赖于特定的核孔蛋白及转录因子的结合位点【2】。尽管Nups在多种生物中均能促进转录，其被招募至特定基因位点的具体机制仍不清楚。

近日，来自美国西北大学分子生物科学系的Jason H. Brickner团队在MolecularCell期刊发表了文章Exportin-1 functions as an adaptor for transcription factor-mediated docking of chromatin at the nuclear pore complex（Exportin-1介导转录因子锚定染色质至核孔复合体）。研究表明，核输出因子 Crm1/Xpo1 能促进转录因子 Gcn4 将染色质锚定至NPC。Crm1 可与 Gcn4 和 Nup2 形成复合物，并在不依赖 Ran-GTP 的情况下增强 Gcn4 的 DNA 结合能力，表明其通过变构调节影响基因表达。

多种酵母转录因子（TFs），如 Cbf1、Gcn4 等，可介导基因向核膜定位【3】，约 65% 的酵母 DNA 结合蛋白具有类似功能。在哺乳动物细胞中，Nups 与富含 TF 结合位点的超级增强子紧密相互作用，表明这一机制可能广泛存在。结构功能分析显示，Gcn4 的中央区域包含一个 27 个氨基酸的片段（PDGCN4），足以介导基因向核膜定位【4】。该区域的突变会破坏其定位功能并降低转录水平，但不影响 Gcn4 的其他功能，表明其在 NPC 介导的基因调控过程中具有特定作用。

Crm1/Xpo1 介导基因定位至核膜

首先，研究人员通过LacO 标记和共聚焦显微镜分析发现，在野生型酵母中，Gcn4 靶基因（HIS1-HIS5 及 URA3:Gcn4BS）在组氨酸饥饿时会移位至核膜，而 gcn4-pd 突变破坏了这一过程，说明PDGCN4对基因核膜定位至关重要。 蛋白质组学分析显示，Crm1 是 Gcn4 的唯一显著富集互作蛋白，其结合依赖 PDGCN4。Crm1 作为主要的核输出因子，通常通过与 NPC 中的 FG 重复 Nups 结合介导蛋白运输。然而，gcn4-pd 突变未影响 Gcn4 的核-胞分布比例，排除了其作为核输出信号的可能性。利用对 Crm1 抑制剂 LMB 敏感的 crm1-T539C 突变株，研究人员发现LMB处理后，Gcn4 靶基因无法再定位至核膜。此外，LMB 还影响了非 Gcn4 靶基因（如 INO1、RPS0A、RPS1B、RPS6A）的核膜定位，表明 Crm1 的作用范围更广。时间动态实验显示，LMB 可在 5-10 分钟内迅速阻断基因向核膜的定位，表明 Crm1 在该过程中发挥直接作用。

Crm1和Nups介导基因定位及转录调控

进一步研究表明，Crm1 和 Nups 在酵母基因组的多个位点均有相互作用，尤其集中在强转录基因的启动子上游区域。研究发现 Crm1 及核孔蛋白 Nup1、Nup2、Nup60 在基因上游区域的切割模式高度相似，特别是在高转录基因（如 TDH3）上游区域，Crm1 和 Nups 的切割信号显著增强，而 Nup157 的切割较弱。此外，进一步分析表明，Crm1 和 Nups 的结合位点与转录因子结合的增强子区域密切相关，提示它们可能通过增强子调控基因表达。Crm1 作为转录因子的适配器，在功能上位于 Nups 之上，并促进 TF 与NPC的结合。当 Crm1 被抑制或去除时，Nup2 的结合及基因向核膜的定位均受到干扰，表明 Crm1 在 Nup2 介导的基因核膜锚定过程中起上游调控作用。此外，Crm1 和 Nups 还与转录过程密切相关。Crm1 和 Nups 的结合模式与 RNA 聚合酶 II 高度相似，而抑制 Crm1 或去除 Nup2 会显著降低新生 mRNA 水平，进一步支持其在转录调控中的关键作用。然而，这些变化未必立即体现在总 mRNA 水平上，表明基因表达可能通过 mRNA 半衰期的调节来缓冲转录水平的波动。基因互作分析进一步揭示，Nup2 与 Mediator 复合体多个亚基存在遗传互作，特别是在 Mediator 头部、中部和激酶亚基之间表现出缓冲效应，表明 Nup2 和 Mediator 在转录调控过程中协同工作。此外，研究还发现，Crm1 能与 NPC 稳定结合，并在基因定位至核膜的过程中发挥关键作用。超过一半的 Nups 能够将基因锚定至核膜，并且这些 Nups 的结合位置与 Crm1 高度重叠，这表明核膜的核质面可直接与染色质相互作用。在体外实验中，研究人员重构了 Crm1-转录因子复合物，并发现 Gcn4 的 C 端定位域（PD）能够与 Crm1 结合，而这一结合不依赖于 Ran-GTP。此外，Crm1 还能增强 Gcn4 的 DNA 结合能力，表明其可能通过稳定 TF-DNA 结合来促进基因在核膜的锚定和转录激活。

综上所述，该研究揭示Crm1/Xpo1是TF介导基因定位至NPC的关键因子。其缺失导致Gcn4及非Gcn4靶基因失去核膜定位，并引发全局转录下降。Crm1与Nup2优先结合，增强Gcn4的DNA结合活性，表明其在NPC-染色质互作中发挥核心作用。

https://doi.org/10.1101/2024.05.09.593355

制版人： 十一

参考文献

1. Lin, D.H., and Hoelz, A. (2019). The Structure of the Nuclear Pore Complex (An Update).Annu. Rev. Biochem.88, 1-59. 10.1146/annurev-biochem-062917-011901.

2. Ahmed, S., Brickner, D.G., Light, W.H., Cajigas, I., McDonough, M., Froyshteter, A.B., Volpe, T., and Brickner, J.H. (2010). DNA zip codes control an ancient mechanism for gene targeting to the nuclear periphery.Nat Cell Biol12, 111. 10.1038/ncb2011.

3. Randise-Hinchliff, C., Coukos, R., Sood, V., Sumner, M.C., Zdraljevic, S., Sholl, L.M., Brickner, D.G., Ahmed, S., Watchmaker, L., and Brickner, J.H. (2016). Strategies to regulate transcription factor-mediated gene positioning and interchromosomal clustering at the nuclear periphery.J Cell Biology212, 633-646. 10.1083/jcb.201508068.

4. Hope, I.A., and Struhl, K. (1986). Functional dissection of a eukaryotic transcriptional activator protein, GCN4 of yeast.Cell46, 885-894.

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