疫苗前沿 | 用于mRNA结核疫苗的最佳UTR序列筛选

：mRNA的非编码区域5'UTR 和 3'UTR影响mRNA的稳定性和翻译效率，其序列设计包括两种常用的方法，一种是寻找天然调控蛋白翻译的UTR序列，来源包括目标宿主或病毒；另一种是从头设计构建工程化的UTR序列。寻找更有效的 5'UTR和3'UTR的最佳组合可能会提高mRNA疗法的疗效，有助于降低其剂量并减少不良反应。尽管mRNA疗法的临床前和临床试验众多，但目前关于调节序列对异源RNA翻译和稳定性影响的研究数量有限。

2024年，俄罗斯索契科学技术大学转化医学研究中心Vasiliy Reshetnikov等人在International Journal of Molecular Sciences发表文章：

Untranslated Region Sequences and the Efficacy of mRNA Vaccines against Tuberculosis

发表期刊: International Journal of Molecular Sciences

发表时间: 2024年1月

应用技术: mRNA序列设计、UTR序列筛选、mRNA二级结构预测、体外转录、RNA纯化、LNP包封、体外试验、细胞转染、mRNA表达量、mRNA疫苗T细胞应答分析、体内动物试验、病毒挑战试验。

01

研究背景

非翻译区（UTR）是位于mRNA 编码区上游和下游的非编码序列。众所周知，UTR 与 mRNA 翻译过程有关。通过与 RNA 结合蛋白 （RBP） 和 microRNA 相互作用，UTR 影响 mRNA 翻译效率和稳定性。一方面，在 5′UTR 中，存在一些影响翻译效率的特定序列，包括末端寡嘧啶束 （TOP） 序列（由 7-14 个胞嘧啶和胸腺嘧啶残基组成，形成 TCT 基序）、内部核糖体进入位点 (IRESs)、不依赖帽子的翻译增强剂子（CITE）、上游开放阅读框 （uORF）以及蛋白质结合基序。这些序列与反式蛋白相互作用，通过依赖或者不依赖帽子的翻译途径触发翻译，其翻译效率取决于细胞状态。另外一方面，富含AU的3′UTR决定着mRNA降解速率。

通常使用珠蛋白（Globin）基因序列确保高翻译效率。特别是，人α-珠蛋白、人β-珠蛋白以及兔β-珠蛋白的基因序列常常被用来提高外源mRNA翻译效率。兔 β-珠蛋白 mRNA 的 5′UTR 被认为可介导高效的帽依赖性翻译，并且，其中不包含任何可能抑制翻译过程的二级结构或序列元件。除了人珠蛋白基因的调控序列外，人热休克蛋白HSP70和组蛋白H3的5′UTR序列也被用作外源mRNA的UTR。已在几种细胞系中证实HSP70 5′UTR 介导翻译具有通用性，而非细胞特异性。还有一些调节元件，如腺病毒 TPL，通过增强翻译起始来提升蛋白表达 。归纳天然 5′UTR 的数据，我们可以得出这样的结论：组成型表达基因的调节序列通常用于提升外源 mRNA 的翻译效率。

与评估 5'UTR 影响的研究相比，评估外源3'UTRs 对目的蛋白表达水平的影响的研究要少得多。人珠蛋白基因的调控序列也用作 3′UTR，以确保 mRNA 的高稳定性和翻译活性。Orlandini von Niessen等使用生物信息学技术对3′UTRs对稳定性和翻译效率的影响进行了系统研究。他们发现，含有 mtRNR1 和 AES 的 3′UTR 促进基因表达。MtRNR1 是线粒体非编码 12S 核糖体 RNA ，而AES 是分裂基因的 Groucho/Transducin 样增强子家族的一个独特成员，它调节雄激素受体基因的转录活性以及 Notch 和 Wnt 信号传导，并充当肿瘤抑制因子。

02

UTR序列影响mRNA翻译效率

研究人员构建了不同类型的5'UTR序列，将其与来自 mRNA-1273 的 3'UTR 组合设计了报告基因Luc mRNA；同时构建了多种3′UTR序列与来自 mRNA-1273 的 5′UTR 组合设计Luc mRNA。将上述不同的mRNA构建体转染DC2.4 和 THP1细胞，检测荧光素酶表达水平。

2.15'UTR序列对mRNA翻译效率的影响

结果显示，在转染DC2.4细胞4h后，与来自mRNA-1273或者BNT162b2的5'UTR介导的荧光素酶翻译效率相比，来自真核基因 HBB、HSPA1A、Rabb 和 H4C2的 5'UTR 、以及来自腺病毒TPL的 5'UTR可显著增强荧光素酶翻译水平。相比之下，在 DC2.4 细胞转染后的后期时间点，这些UTR介导的翻译效率差异消失。在 THP1 细胞系中，与C3 5'UTR序列介导的荧光素酶翻译水平相比，来自人 β-珠蛋白 5'UTR 序列介导的Luc mRNA在转染后 24 小时也显示更高水平的荧光素酶表达。

总体来看，在细胞系之间观察到不同5′UTR介导的mRNA 翻译效率的差异表明5′UTR具有明显的细胞特异性。为解决5′UTR导致的细胞间表达差异，青鸟核酸（RNASci）建立了天然及工程化5′UTR文库，可用于不同mRNA、不同靶细胞的筛选实验。详细请联系菌菌：199 2658 2926。

2.2 3'UTR序列对mRNA翻译效率的影响

与 5'UTR 的结果类似，转染含有不同 3'UTR 的 Luc RNA 后荧光素酶表达差异仅在 DC2.4 细胞系中观察到。一方面，转染后不同时间点的荧光素酶活性显示3'UTR 序列 AES-HBB 和 mtRNR-HBB显示介导表达最低水平的荧光素酶活性。由于 3'UTR 主要负责细胞中 RNA 的稳定性并防止通过与 microRNA 结合介导的 RNA 降解，因此结果表明3'UTR 序列 AES-HBB 和 mtRNR-HBB 会导致mRNA稳定性降低。另一方面，与mRNA-1273或BNT162B2 3'UTR 介导的翻译相比，测试的 3'UTR 序列均未显著提升荧光素酶表达水平。与 mRNA-1273 3'UTR 相比，即使是 3'UTR 序列 AES-EMCV——在转染 DC2.4 细胞后 8 小时，在细胞中介导表达相对更高水平的荧光素酶活性—在 DC2.4 细胞转染后 72 小时也显示出介导表达更低水平的荧光素酶活性。与DC2.4 细胞系相比，在THP1细胞系中， AES-AES、AES-EMCV 和 AES-HBB介导表达的荧光素酶活性均比mRNA-1273或者BNT162B2 3'UTR介导的要低。

03

THP1 和DC2.4细胞翻译机制特征

接下来，研究人员试图回答细胞系翻译机制的哪些特征可以解释观察到的 5'UTR 和 3'UTR 对翻译效率影响差异的问题。为此，通过公开可用的转录组学数据，他们评估细胞系 THP1 和 DC2.4 中 RBP 基因的表达水平。结果显示，THP1 和 DC2.4 细胞之间 85 个RBP基因的表达不同，其中20 个差异表达的RBP基因在本研究的UTR序列中具有假定的结合位点。

04

全面表征5'/UTR序列特征

研究人员试图全面表征测试UTR序列，例如，对于5'UTR序列计算平均核糖体负荷（MRL），对于3'UTR序列计算吉布斯自由能。然后，分析 MRL 和 Gibbs自由能的值与细胞系转染后生物发光相对水平数据的相关性。此外，在所有测试的 5'UTR 和3'UTR 序列中，都对 RBP 的结合位点进行搜索。

在DC2.4细胞中转染4h，MRL与细胞中荧光素酶活性呈显著相关性，而在转染后24h和72h，MRL 与细胞中表达的荧光素酶活性呈微弱相关性。然而，在 THP1 细胞系中，这些参数之间没有相关性。研究人员未能发现最小自由能 （MFE）（单独 3'UTR 或整个 RNA）与细胞中表达的荧光素酶活性之间的相关性。

研究人员发现大多数测试 5′UTR 和 3′UTR 序列包含各种 RBP 的预测结合位点，其中许多直接影响 mRNA 的稳定性和翻译效率。尽管如此，结合位点的存在与 RNA 稳定性之间的直接关系很难辨别，因为一些 RBP 稳定 RNA，一些破坏 RNA，而其他RBP需要根据细胞环境来调节 RNA 稳定性，如 PCBP2。还应该指出的是，目前，大多数 RBP 影响mRNA 稳定性和翻译效率的研究不足，而且，这种影响很大程度上取决于结合区（5'UTR、ORF 或 3'UTR）和其他辅助蛋白的存在。

值得注意的是，前五个 UTR 中的三个（来自 HBB、Rabb 和 H4C2 mRNA）没有 RBP 结合位点，而其他两个（TPL 和 HSPA1A）携带 RBP 的结合位点，其对 RNA 稳定性的影响尚不清楚。关于 3'UTR，只有序列 mtRNR-mtRNR 和 mRNA-1273 3'UTR（两者都产生最佳表达）包含 RBP 的预测结合位点 HNRNPK，它与稳定mRNA有关。

05

腺病毒TPL序列作为5'UTR开发结核疫苗

TPL 是腺病毒晚期 mRNA 的 5′UTR 中的核苷酸序列，以前被认为以不依赖帽的方式启动晚期腺病毒 mRNA 的翻译。TPL 包含一个内部核糖体进入位点，使其能够独立于与 mRNA 帽结构的相互作用募集核糖体。目前，尚不清楚 TPL 序列是否能够以不依赖帽的方式启动翻译。

TPL 为 5'UTR 序列，在 DC2.4 细胞系中介导荧光素酶表达显示出最佳结果，并且具有最高的 MRL，因此，研究人员在编码针对结核分枝杆菌的多表位 mRNA 疫苗的构建体中选择TPL 为 5'UTR，选择来自mRNA-1273 的 3′UTR 。

对接种结核mRNA疫苗的小鼠进行 ELISpot 测定，计算分泌 IFNγ 的脾细胞，从而评估所疫苗触发的T细胞反应的强度。与对照组小鼠脾脏细胞相比（注射PBS或者空壳LNP），TPL 为 5'UTR 序列的mRNA疫苗

刺激小鼠后，分泌 IFNγ的脾脏细胞数量明显增加，而以mRNA1273-5'UTR作为5'UTR 序列的mRNA疫苗刺激小鼠后，分泌 IFNγ的脾脏细胞数量略微增加但不显著。TPL - 5'UTR 结核疫苗刺激产生的分泌 IFNγ的脾脏细胞数量是mRNA1273-5'UTR结核疫苗的2倍多。

结核疫苗的接种会触发迟发型超敏反应，与注射 LNP 的小鼠组相比，注射TPL - 5'UTR 结核疫苗的小鼠显示结核菌素注射部位显著扩大。另一方面，注射mRNA1273-5'UTR结核疫苗的小鼠结核菌素注射部与对照组无明显差异。

小鼠注射两剂结核疫苗后，在第42天进行结核菌攻毒，测定免疫小鼠肺部的细菌载量。与对照组小鼠脾脏细胞相比（注射PBS或者空壳LNP），TPL - 5'UTR 结核疫苗注射组肺部的细菌载量显著降低，而注射mRNA1273-5'UTR结核疫苗的小鼠肺部的细菌载量降低了 >1.5 倍，但差异在统计学上不显著。

综上所述，5'-TPL-mEpitope-mRNA1273-3' 疫苗诱导了更强的适应性免疫和对结核分枝杆菌的保护。因此，选择TPL 序列作为5′UTR可以显着提高 mRNA 治疗的有效性。

06

结语

在这项工作中，研究人员使用测试了多种来源（HBB 、 HSPA1A 、 Rabb、H4C2 或 TPL）的5' UTR 序列对Luc mRNA在DC2.4 细胞中翻译的影响。结果发现，这些5′UTR介导的荧光素酶活性翻译效率要高于mRNA-1273 和 BNT162b2 mRNA 疫苗的 5'UTR 序列介导的。接着，他们对这些5‘UTR序列进行了计算机分析并预测了 MRL 值，发现MRL 值与细胞中Luc mRNA表达的荧光素酶活性呈现相关性。最后，他们得到一种在细胞中具有最高翻译效率和最高MRL值5′UTR，即腺病毒TPL序列，并基于此序列开发出一种针对结核分枝杆菌的多表位 mRNA 疫苗（5'-TPL-mEpitope-mRNA1273-3'），该疫苗可有效触发T细胞免疫反应和高效的免疫保护。

目前，已公开的结核mRNA疫苗有两种：第一种是基于全长 MPT83 抗原的 mRNA 疫苗，可触发特异性结核抗体的产生；第二种是包含四种全长结核抗原（ID91）与TLR4 激动剂融合的 mRNA 疫苗。本研究首次使用TPL 序列作为5′UTR构建结核mRNA疫苗。与 mRNA-1273 的 5'UTR 相比，使用 TPL 作为 5'UTR 在小鼠中引起了更明显的保护性适应性免疫反应，从而导致 mRNA 疫苗对结核病的临床前疗效更高。结核mRNA 疫苗的进一步优化可能包括增加编码表位的数量、改变 cap 的类型（从 cap0 到 cap1）和调整剂量。使用 HBB来源的 5' UTR 也值得进一步研究。

参考文献

[1] Reshetnikov V, Terenin I, Shepelkova G, Yeremeev V, Kolmykov S, Nagornykh M, Kolosova E, Sokolova T, Zaborova O, Kukushkin I, Kazakova A, Kunyk D, Kirshina A, Vasileva O, Seregina K, Pateev I, Kolpakov F, Ivanov R. Untranslated Region Sequences and the Efficacy of mRNA Vaccines against Tuberculosis. Int J Mol Sci. 2024 Jan 10;25(2):888. doi: 10.3390/ijms25020888.

[2] Zhang L, More KR, Ojha A, Jackson CB, Quinlan BD, Li H, He W, Farzan M, Pardi N, Choe H. Effect of mRNA-LNP components of two globally-marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 2023 Oct 11;8(1):156. doi: 10.1038/s41541-023-00751-6.

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撰写| 工程菌星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice