2025年4月22日，耶鲁大学张凯团队在Nature Structural & Molecular Biology期刊发表最新研究成果：“The Mechanochemical Cycle of Reactive Full-length Human Dynein-1”，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了处于反应态全长人源动力蛋白-1（dynein-1）马达域（motor domain）在ATP水解以及微管结合/脱离过程中的多个关键中间态，描绘了其迄今最完整的高分辨动态构象全景图。该研究不仅填补了动力蛋白研究中长期缺失的结构环节，更为揭示细胞内动力蛋白如何将ATP的化学能高效转化为方向性机械力的机制提供了核心线索。

Dynein是细胞内最关键的分子运输机器之一，主导几乎所有沿微管负向运输的细胞内活动。它介导多种细胞器和胞内货物的定位与动态调控，包括线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体、自噬小体、RNA-蛋白复合物（RNPs）、蛋白聚集体、各类囊泡、细胞核、甚至细胞骨架成分等。由于这些过程非常基本，所以dynein介导的微管负向运输对人体生命活动至关重要，包括但不仅限于神经和运动系统发育、免疫细胞功能极化、变性和聚集蛋白质的清除、精子形成、纤毛和鞭毛运动、以及胚胎发育中的细胞迁移和极性建立等，其功能障碍已被明确关联于多种神经退行性疾病、遗传性发育障碍和免疫缺陷综合征。除了细胞本身的天然货物，dynein同样在多种病毒（包括但不仅限于冠状病毒、HIV、狂犬病毒、疱疹病毒、腺病毒等）及其他病原体在宿主细胞中的定位与复制过程中发挥重要作用。这些高度动态的基本生命活动，其核心驱动力来源于dynein结合并水解ATP所驱动的机械化学循环，深入理解该循环机制是揭开这些生命过程相关的一系列谜团的关键。

动力蛋白是所有马达蛋白中结构最庞大、机制最复杂的一类，其重链的核心马达结构域由一个包含六个不同AAA+结构域的环状ATP酶马达域（AAA+ ring）构成，辅以杠杆臂（linker）、微管结合域（MTBD）等多个功能模块。在一个完整的ATP水解循环中，这些结构区域协同变化，实现“步态”转换与力的输出。

理解动力蛋白的工作机制的一个核心挑战在于捕捉马达域在ATP水解以及微管结合/脱离过程中的各种中间构象。基于这些中间构象，并结合生化实验、单分子动力学等研究，研究人员潜在地可以构建出整个循环周期 (Schmidt and Carter 2016)。尽管过去已有多项关于马达域的结构研究（包括晶体结构、单颗粒冷冻电镜、冷冻断层电镜等），但是领域对动力蛋白工作机制的深入理解仍存在显著局限和瓶颈，主要包括：

1）缺乏关键中间态结构。以往研究多采用截短体、ATP类似物或特定底物稳定特定构象，难以捕捉到马达域在不同功能状态下的连续构象变化。

2）缺乏结合微管时的高分辨结构。由于动力蛋白结合微管的非对称性和低密度装饰等特性，传统解析微管结合蛋白的单颗粒冷冻电镜流程难以适用。

为解决上述技术瓶颈，张凯团队在单颗粒冷冻电镜方法进行了新的探索和创新（见图1）：

图1：全长人源动力蛋白-1的冷冻电镜结构分析。(a, b)冷冻电镜实验流程示意图。(c) phi构象”动力蛋白冷冻电镜图，尾部分辨率为3.8–7.0 Å，马达域达2.2 Å。(d) 开放构象动力蛋白马达域在多种功能状态下的代表性结构。(e) 结合微管的双头动力蛋白整体分辨率为10 Å，局部马达域精修至2.9–3.6 Å。(f) 展示高分辨率结构细节。

1）针对关键中间态结构的缺失，团队在样品准备中使用全长动力蛋白，并在制样过程中特意使用ATP处理，使马达域处于动态的ATP水解循环中。相比之下，在传统研究中这种处理则是大忌，因为这和结构生物学要求的稳定状态的复合物这个理念刚好背道而驰。而本项工作中，研究团队反其道而行之，特意收集高度活跃和柔性处于“工作状态”下动力蛋白的冷冻电镜数据，结合系统深入的三维分类，重建出多达10种主要功能状态（不包括进一步的局部细分类）的马达域高分辨结构（2.2 Å – 3.6 Å），包括多个此前未被报道的中间态。

2）针对微管结合状态解析的难点，张凯团队首先收集了动力蛋白与微管复合物的冷冻电镜数据。为去除微管密集的周期性背景信号，研究团队采用此前开发的“微管曲线拟合 + 信号剥离”方法(Chai, Rao and Zhang 2022)，成功消除微管信号干扰，从而实现了动力蛋白与微管结合状态的高分辨重构。这一方法在2021年首次帮助团队解析了外臂动力蛋白结合微管的高分辨结构(Rao, Han et al. 2021)（详见BioArt报道：），并持续推动着动力蛋白结构研究领域的进展。在最新的研究中，团队对dynein-1多种核苷酸结合状态和微管结合状态进行系统分析，最终获取了40多个不同状态的高分辨率全长人类dynein-1结构，从而构建出一个接近完整的dynein-1动态构象全景图。

研究亮点有：

1）高分辨马达域连续变化构象：通过大规模三维分类与重构，研究系统捕获了ATP驱动下动力蛋白马达结构域的一系列关键构象，完整覆盖其ATP水解循环过程（图2）。其中，分辨率最高的状态高达2.2 Å，首次在动力蛋白中清晰观察到活性位点水分子，直接证明该状态为ATP水解后构象（含ADP、镁离子及螯合水）。此外，研究还重建了活性口袋从“关闭”到“开放”的多个中间态，揭示AAA+环通过构象变化调控口袋开合，进而影响马达对微管的亲和力，为理解其力学-化学耦合机制提供关键线索。

图2：未结合微管的动力蛋白马达域在反应中的构象分布。(a)动力蛋白马达域在催化循环中的八个主要状态，分为自我抑制状态（左）和活跃循环状态（右）。(b, c) 2.2 Å分辨率下的AAA1活性口袋冷冻电镜图及氢键网络。(d) 卡通模型展示AAA1从关闭到开放的动态变化。

2）揭示磷酸释放“分子后门”机制：磷酸释放过程高度动态，一直是动力蛋白机制研究中的技术难点。此次研究发现，在活性口袋“关闭”状态下，杠杆臂（linker）竟可呈现出直立与弯曲两种状态——这一现象和此前的机制理解大相径庭。深入分析表明，尽管活性位点封闭，靠近活性口袋末端的sensor-I loop区域却显示出多种不同构象，暗示磷酸可通过该“分子后门”路径释放（图3）。此发现为理解磷酸如何从马达内部释放，并调节杠杆臂的构象提供了崭新视角，为动力蛋白的完整机制模型填补关键一环。

图3：磷酸释放的分子后门机制。(a, b) sensor-I环在ATP条件下表现出构象异质性。(c, d) 比较闭合AAA1状态下结合的核苷酸与sensor-I环的结构以及分子后门。

3）杠杆臂构象调控与步态机制偶联：以往研究认为，杠杆臂由弯曲状态转为直立状态是动力蛋白产生力的“动力冲程（powerstroke）”，该过程也与其结合微管相伴发生。然而，该模型无法解释动力蛋白如何完成一步前进动作，因此“动力冲程”与“步态”之间的构象联系长期缺失。本研究通过系统解析动力蛋白结合和脱离微管时的构象，发现杠杆臂在AAA+环上的多种构象，尤其识别出三个关键构象：pre（弯曲态）、post-1（直立态-1）和post-2（直立态-2）。进一步分析表明，post-2 构象与马达在微管上的跨步过程高度相关。值得一提的是，研究团队此前在外力臂调控中的结构研究中首次观察到dynein的post-2状态并提出其潜在和dynein的跨步相关，但该状态的生理意义和具体的机制并不清楚。本次研究利用全长人源dynein-1，不仅重新观察到了dynein-1同样存在post-2状态，并且还捕获了大量的中间态构象，清楚回答了dynein-1在完成一个动力冲程之后更加偏好post-2这个状态，从而揭示了dynein-1的linker构象变化如何驱动步态转变，非常清晰地将“步态机制”与“动力冲程”机制在结构层面实现耦合 （图4）。

图4：微管促进ATP酶活性并驱动动力蛋白沿微管单向行走的机制。(a)不同核苷酸条件下微管结合的动力蛋白马达域的高分辨率冷冻电镜图。(b, c) 动力蛋白机制化学循环加速的示意图。(d, e) 动力蛋白沿微管单向行进的机制。

此外，本研究还绘制了迄今最完整的动力蛋白马达域构象图谱，为基于大规模结构数据的统计分析提供了坚实基础。研究团队系统提取了各关键中间态的结构特征，进一步揭示微管如何通过构象调控加速ATP水解，并解析AAA+环内其他AAA结构域在此过程中的协同作用机制。除结构解析外，来自科罗拉多州立大学Steven M. Markus课题组的Indigo C. Geohring还提供了关键的功能验证实验，印证了结构发现的生物学意义。

https://www.nature.com/articles/s41594-025-01543-3

参考文献：

1. Chai, P., Q. Rao and K. Zhang (2022). "Multi-curve fitting and tubulin-lattice signal removal for structure determination of large microtubule-based motors." J Struct Biol214(4): 107897.

2. Rao, Q., L. Han, Y. Wang, P. Chai, Y. W. Kuo, R. Yang, F. Hu, Y. Yang, J. Howard and K. Zhang (2021). "Structures of outer-arm dynein array on microtubule doublet reveal a motor coordination mechanism." Nat Struct Mol Biol28(10): 799-810.

3. Schmidt, H. and A. P. Carter (2016). "Review: Structure and mechanism of the dynein motor ATPase." Biopolymers105(8): 557-567.

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