微生物限度检测是评估药品、食品、化妆品等样品中微生物污染水平的关键操作，其核心在于通过科学规范的步骤确保结果准确可靠。以下从操作前准备、检测流程、关键控制点三个维度，系统阐述微生物限度检测的核心步骤及注意事项：

一、操作前准备

1. 实验环境与设备

  • 洁净区确认
    • 微生物限度检查需在C级或D级洁净区进行，操作前需确认环境压差（≥10Pa）、温湿度（通常为18-26℃，45-65%RH）及尘埃粒子数符合要求。
    • 关键设备（如微生物限度检查仪、高压灭菌器、生物安全柜）需通过计量校准，并处于有效期内。
  • 器具灭菌
    • 实验用玻璃器皿（如培养皿、吸管）、滤膜（通常为0.45μm孔径）需经121℃高压灭菌15分钟，金属器具可干热灭菌（160-170℃，2小时）。

2. 试剂与培养基

  • 培养基配制
    • 根据检测项目选择适宜培养基（如营养琼脂用于菌落总数，玫瑰红钠琼脂用于霉菌和酵母菌计数）。
    • 配制后需进行适用性检查（如接种标准菌株，验证促生长能力）。
  • 稀释液
    • 常用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，需经灭菌处理。

3. 样品处理

  • 预处理
    • 固体样品（如药片）需研磨均匀，液体样品可直接稀释。
    • 含抑菌成分的样品（如抗生素）需通过中和法（如添加硫代硫酸钠中和碘伏）或薄膜过滤法消除干扰。

二、核心检测步骤

1. 供试液制备

  • 称量与稀释
    • 称取样品10g（或10mL），加入90mL稀释液，制成1:10供试液，必要时进行10倍系列稀释（如1:100、1:1000）。
    • 示例：检测某药片时，将10片药片研磨后称取1g，加入9mL稀释液，制成1:10供试液。

2. 微生物过滤与分离

  • 薄膜过滤法（主流方法）
    1. 滤膜安装：将灭菌滤膜置于滤杯中，连接真空泵。
    2. 过滤供试液：取1:10供试液1mL注入滤杯，抽滤至干，用200mL冲洗液（如稀释液）分次冲洗滤膜，去除抑菌成分。
    3. 滤膜转移：用无菌镊子将滤膜贴于培养基表面（菌落总数面朝上，霉菌和酵母菌面朝下）。
  • 平皿法（替代方法）
    • 取1:10供试液1mL注入无菌平皿，倒入15-20mL冷却至45℃的培养基，混匀凝固。

3. 培养与计数

  • 培养条件
    • 菌落总数：30-35℃培养3天。
    • 霉菌和酵母菌：20-25℃培养5天。
    • 控制菌（如大肠埃希菌）：需增菌后接种鉴别培养基（如麦康凯琼脂）。
  • 菌落计数
    • 选取菌落数在30-300CFU的平板进行计数，若所有稀释度均超出范围，则以最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
    • 示例：1:1000稀释度平板菌落数为45，则结果为4.5×10⁴ CFU/g。

三、关键控制点与注意事项

1. 防止假阴性/假阳性

  • 假阴性
    • 样品抑菌成分未完全中和，或滤膜堵塞导致微生物截留不全。
    • 解决：增加冲洗液体积或采用中和剂（如β-内酰胺酶中和青霉素）。
  • 假阳性
    • 培养基污染或操作环境洁净度不足。
    • 解决：设置阴性对照（未接种的培养基）验证培养基无菌性。

2. 结果报告规范

  • 单位：固体样品以CFU/g表示，液体样品以CFU/mL表示。
  • 限值判定：根据药典或行业标准（如《中国药典》2020版）判定是否超标。
    • 示例：非无菌制剂的菌落总数限值为1000CFU/g，霉菌和酵母菌限值为100CFU/g。

3. 异常情况处理

  • 可疑菌落
    • 对形态异常菌落进行鉴定（如革兰氏染色、生化试验），确认是否为致病菌。
  • 数据修正
    • 若两个稀释度平板菌落数比值＞2，以接近1:15的平均菌落数计算（如1:10为120，1:100为15，则结果为1.35×10³ CFU/g）。

四、总结

微生物限度检测需严格遵循供试液制备→过滤分离→培养计数→结果判定的流程，核心在于：

  1. 环境控制：确保洁净区符合标准，避免交叉污染。
  2. 方法选择：根据样品特性选择薄膜过滤法或平皿法。
  3. 结果准确：通过阴性对照、阳性对照及方法学验证确保可靠性。

关键公式

微生物限度（CFU/g或mL）=平板菌落数×稀释倍数/取样量
通过标准化操作与严格质控，可有效保障产品质量安全。