Nature | 亓磊/韩梦婷团队开发新型可编程的空间转录组调控技术CRISPR-TO

空间转录组（spatial transcriptome）调控细胞中大分子在 时空 上的定位，对RNA代谢 ， 局部翻译（local translation） ，以及细胞生理功能 具有重要影响。自1983年首次发现海鞘胚胎中不对称的肌动蛋白mRNA亚细胞定位，各种生物系统中都陆续发现了独特的RNA空间定位模式。空间转录组的生物学意义在大型、不对称细胞（如神经元）中尤为重要。通过在正确的时间和位置放置特定的RNA，神经元有效地弥合了从纳米级分子到比其大六到九个数量级的细胞之间的巨大尺度差异。随着研究的深入，异常的RNA定位也被发现与越来越多的疾病相关，尤其是神经系统疾病，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脆性X综合征（FXS）和脊髓型肌萎缩症（SMA）等。

高通量成像（如MERFISH）和测序方法（如APEX-seq）揭示了数千种RNA在不同生物体系中的特定空间定位。然而，此前学术界对于空间转录组的功能探索 非常有限， 仅限于少数RNA 。其 主要原因是目前人们使用的技术难以在细胞，尤其是原代细胞（如神经元）中操纵内源RNA的空间定位。传统的 操纵 RNA空间定位的方法通常需要使用MS2重复序列标记RNA，并通过MS2衣壳蛋白（MCP）调控RNA在细胞中的空间定位来实现功能研究。但该方法需要对内源基因进行编辑，因此难以进行高通量操控，而且该方法在原代细胞中的应用存在挑战。

2025年5月21日，斯坦福大学的亓磊实验室在Nature杂志 在线 发表了题为

Programmable control of spatial transcriptome in live cells and neurons

CRISPR-TO利用II类VI型CRISPR-Cas13系统进行空间转录组的调控。II类VI型CRISPR-Cas13系统是一种在RNA引导下靶向RNA的核糖核酸酶（RNA-guided, RNA-targeting ribonuclease）。通过突变Cas13的核糖核酸酶结构域可以获得其失活变体dCas13 (dead Cas13)。dCas13能够高效且特异性地结合目标RNA，而不会导致其降解。利用这一可编程性，作者开发了CRISPR-TO，将dCas13与介导亚细胞定位的信号肽段/蛋白或马达蛋白（motor protein）通过化学诱导的异二聚化机制（heterodimerization）相结合，通过两种模式—被动扩散与停靠（passive diffusion and docking），以及主动运输（active transport）—实现了可诱导、可逆的靶向RNA定位。

CRISPR-TO技术的核心优势在于其能够在不改变基因序列的前提下，轻松实现对内源RNA分子亚细胞定位的精准时空调控。 利用CRISPR-TO，作者成功实现了对内源RNA（包括mRNA和noncoding RNA）在不同细胞类型中多种亚细胞区室的空间靶向定位调控，包括线粒体外膜，P-小体（p-body），应激颗粒（stress granule），端粒，核应激小体（nuclear stress body），以及由马达蛋白介导的沿微管进行的双向主动RNA运输。而通过将CRISPR-TO与活细胞RNA成像技术相结合，作者实现了对活细胞中RNA定位动态的实时操控和观测。在研究过程中，作者发现将mRNA靶向定位到P-小体显著降低了mRNA的降解常数，并延长了mRNA的半衰期。这些结果为尚存争议的P-小体功能提供了关键实验证据，支持了“P-小体的主要功能是mRNA存储位点而非降解场所”的理论。

除了 肿瘤细 胞系，作者还在体外培养的原代小鼠皮层神经元（primary mouse cortical neuron）中利用CRISPR-TO成功实现了内源mRNA在活细胞中的超长距离（约1 mm）运输。此外，该系统还可以通过共表达多个向导RNA（gRNA）轻松实现对多个mRNA的共同运输和定位调控，以研究其协同作用，而这种协同调控利用以往任何一种方法都很难实现。作者通过超分辨成像技术成功观测到了被CRISPR-TO运输的内源β-肌动蛋白mRNA（ACTB mRNA）与核糖体共同运输，并在神经突和神经突末端进行局部翻译。有趣的是，将内源β-肌动蛋白mRNA定位到神经突末端 迅速 增强了动态丝状伪足突起（filopodial protrusion）的形成，同时抑制了损伤后轴突的再生。

该项研究的另一突破在于，CRISPR-TO技术的可编程性使其能够进行高通量筛选（high-throughput screening），从而使空间转录组功能的系统性研究成为可能。 作者进行了基于CRISPR-TO的阵列化筛选，以评估21种 内源 mRNA在原代小鼠皮层神经元的神经突中的定位对神经突生长的影响。通过自动化高内涵显微成像（high-content automated microscopy）对神经突生长进行追踪，作者发现将 Stmn2 mRNA运输定位到神经突可以驱动神经突的快速生长。 Stmn2 mRNA编码微管结合蛋白Stathmin-2，参与微管动力学和突触再生，并且和肌萎缩侧索硬化（ALS）的病理过程有关。此前通过微阵列分析观察到 Stmn2 mRNA的轴突定位，但其功能意义仍不清楚。本文作者通过RNA荧光原位杂交（RNA FISH）和不同条件下对神经突生长实验的重复，成功验证了CRISPR-TO介导的 Stmn2 mRNA在神经突中的富集，并验证了上述亚定位变化对神经突生长的促进，为治疗肌萎缩侧索硬化症提供了新的研究思路。

通过对空间转录组进行精准、可逆和大规模的时空调控，CRISPR-TO弥合了现有测序和成像技术留下的关键空白，提供了一个高通量研究空间转录组功能的平台，未来将极大地促进不同生物学系统和疾病背景下对空间转录组的功能研究。

本文通讯作者为斯坦福大学生物工程系的亓磊教授。亓磊教授是CRISPR领域的先驱，从天然CRISPR-Cas9核酸酶中开发出了 首 个核酸酶失活型dCas9。亓磊教授实验室开发了一系列CRISPR工具，包括用于基因表达调控的CRISPRi和CRISPRa ，表观遗传学精准调控， 用于DNA和RNA实时成像的LiveFISH和Oligo-LiveFISH ，微型CRISPR分子，以及大规模转录组调控的工具MEGA-Cas13等 工具，极大地丰富了CRISPR工具箱，并将CRISPR的应用扩展至基因编辑以外的领域。这些CRISPR工具在科研和转化医学领域已经得到广泛应用 ，包括基于CRISPR的表观遗传学调控工具已经进入临床转化治疗肌肉萎缩症。

图注：a-b, CRISPR-TO在细胞系（a）和神经元（b）中的工作原理示意图。c, 利用CRISPR-TO在原代小鼠皮层神经元（白色）中实现对内源β-肌动蛋白mRNA（红色）沿神经突的超长距离运输。

第一作者韩梦婷博士本科和博士毕业于北京大学化学与分子工程学院，博士阶段导师为陈兴教授，现为斯坦福大学生物工程系博士后。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09020-z

韩梦婷博士将于2025年8月以助理教授身份入职美国印第安纳大学布卢明顿分校（Indiana University Bloomington）生物系并开设实验室。实验室将致力于开发新型化学生物学、合成生物学和CRISPR技术来研究不同生物学体系中空间转录组的调控机制、生物学功能及其在疾病发展中的作用，并从空间转录组的角度出发，深入探索神经退行性疾病的新型治疗策略。 实验室长期欢迎对相关研究方向感兴趣的研究生和博士后加入，期待与您共同探索生命科学的奥秘 。

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