肿瘤微环境 （ TME ）是肿瘤细胞周围的动态生态系统， 在肿瘤的发生、发展 、免疫逃逸和治疗耐受 方面起着至关重要的作用。 TME 具有高度的异质性、复杂性和动态性，在这一动态网络中， 蛋白质翻译后修饰（ PTM ） 的异常调控是免疫抑制性 TME 形成的关键因素。既往研究通过转录组学、表观遗传组学、蛋白组学系统解析了 TME 动态变化的多维度特征，然而此类方法均存在一定局限性。相比之下， PTM 具有特异性高、精准性强、响应速度快等优势。目前因缺乏单细胞水平研究 PTM 的策略，导致 TME 中免疫细胞的 PTM 特征和空间分布尚不清楚。

近日，重庆大学附属肿瘤医院的 李咏生团队 在美国癌症研究协会（ AACR ）期刊 Cancer Immunology Research 发表了题为Single-cell analysis of post-translational modifications identifies immunosuppressive macrophage subtypes in the HBV-positive hepatocellular carcinoma microenvironment的研究论文。该研究联合质谱流式细胞术（ CyTOF ）、质谱（ MS ）和成像质谱流式（ IMC ）技术构建了单细胞层面表征蛋白质PTM的方法；通过此策略初步绘制HBV+肝细胞癌（ HCC ）的PTM景观，并基于单细胞蛋白磷酸化特征鉴定出与HCC临床预后和免疫治疗反应密切相关的M2巨噬细胞新亚型。

肝细胞癌（ HCC ）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。然而 HCC 对 PD-1/PD-L1 抗体为代表的 ICI 治疗响应率较低，单药仅约 20% 的患者可获益；抗血管生成药物联合 ICI 方案的疗效优于任何单一疗法，但其总反应率仍然不到 50% 。肝脏是机体代谢的核心器官，且 HCC 是免疫代谢最为复杂的癌种之一。考虑到 PTM 以代谢物为底物，该团队选择 HCC 作为研究对象。首先，研究人员通过标记 36 种免疫细胞标志物与 4 类关键 PTM （乙酰化、乳酸化、泛素化、磷酸化），建立了 PTM- CyTOF -IMC 方案 。研究人员收集了本单位的 HBV 阳性 HCC 样本及对应的癌旁组织（ n=5 ），通过 CyTOF 分析发现，肿瘤浸润髓系细胞的整体酪氨酸磷酸化水平显著下调 ； 与癌旁 组织 相比，肿瘤 组织 浸润的髓 系 细胞中单核细胞、巨噬细胞、经典型树突状细胞等亚型细胞 的 整体酪氨酸磷酸化 水平 显著下调，这表明肿瘤相关髓系细胞的磷酸化状态的改变可能参与 HCC 进程。

随后研究人员分选出 HCC 及对应的癌旁组织中浸润的髓系细胞，通过 MS 分析其磷酸化及蛋白组 ， 并通过与免疫调节、代谢调节等通路取交集分析，筛选出 p-HSP27 （ S82 ） 、 p-STAT1 （ S727 ） 与 p-TRIM28 （ S473 ） 。通过 WB 和 IMC 技术进一步验证， HCC 肿瘤组织中髓系细胞的 p-HSP27 、 p-STAT1 和 p-TRIM28 表达均高于癌旁组织，且这主要是由于肿瘤浸润的 M2 型巨噬细胞中 p-HSP27 、 p-STAT1 和 p-TRIM28 的表达升高引起的。

接下来，为进一步探讨 p-HSP27 、 p-STAT1 和 p-TRIM28 与 M2 型巨噬细胞分型及功能的区别。研究人员基于三种磷酸化蛋白表达特征，将 M2 型巨噬细胞划分为四个亚型： M2-P0 （不存在任何 1 种磷酸化蛋白）、 M2-P1 （存在 1 种磷酸化蛋白）、 M2-P2 （存在 2 种磷酸化蛋白）、和 M2-P3 （存在 3 种磷酸化蛋白）。 结果表明， M2-P0 主要富集在癌旁组织，而 M2-P1 、 M2-P2 和 M2-P3 主要在 HCC 组织 。和 M2-P0 相比， M2-P1 、 M2-P2 和 M2-P3 表达更多的 LAG-3 、 PD-L1 、 S iglec-10 、 TIM-3 等免疫抑制分子，这表明 M2-P1 、 M2-P2 和 M2-P3 可能促进 HCC 免疫抑制性 TME 的生成。

研究者通过 IMC 空间分析发现：越接近 M2-P1~P3 的 CD8 + T 细胞，其表达的免疫检查点分子（如 PD-1 、 LAG-3 、 TIM-3 ）与活化标志物（如 GZMB 、 CD28 ）越高，提示这类 CD8 + T 细胞可能对免疫检查点抑制剂（ ICIs ）更敏感；而 M2-P0 与之相反。进一步分析 HCC 临床样本发现，在接受免疫治疗的患者中， M2-P2 与 M2-P3 高浸润与更长的无进展生存期（ PFS ）显著相关 。此外，在免疫治疗高响应组（ HR ， n=9 ）中， M2-P2 与 M2-P3 的含量显著高于低响应组（ LR ， n=5 ），其预测效果显著优于传统免疫治疗生物标志物（如 PD-L1 表达、 T 细胞数量）。研究人员进一步通过细胞邻域（ Cellular Neighborhood ）分析 M2-P0~P3 临近细胞的特征。发现 M2-P2 和 M2-P3 所处区域（ CN2/CN3 ）中肿瘤细胞高表达 “ Don ’ t eat me ” 信号（ CD47 、 CD24 ），且该区域中 CD8+T 和 CD4+T 细胞表达更多免疫检查点分子（ PD-L1 、 CTLA-4 、 LAG-3 及 TIM3 等），呈现最强免疫抑制状态， 可能是免疫治疗反应最显著的“潜力区 ”。

单细胞PTM组学分析—流程图

综上，为了增进对 HCC 肿瘤微环境的理解，该团队采用了 一种整合的 空间 单细胞翻译后修饰（ PTM ）分析方法，初步 绘制了 HBV+ 阳性 HCC 的 PTM 景观，并 基于磷酸化蛋白表达 鉴定出了与 HBV 阳性 HCC 免疫治疗反应相关的巨噬细胞亚型 。该研究为肿瘤微环境的研究以及开发新型免疫治疗预测标志物提供 了 一种全新的思路。

重庆大学附属肿瘤医院肿瘤内科赵化侃副研究员和重庆大学医学院博士研究生任然为本文的共同第一作者，李咏生教授为本文通讯作者。

原文链接：https://aacrjournals.org/cancerimmunolres/article/doi/10.1158/2326-6066.CIR-24-1298/762823/Single-cell-analysis-of-post-translational

专家点评

叶丽林（ 陆军军医大学 国家杰青）

李咏生团队首次整合质谱流式细胞术（ CyTOF ）、质谱（ MS ）和成像质谱流式（ IMC ）技术，构建了单细胞分辨率下的蛋白质翻译后修饰（ PTM ）全景图谱，突破了传统组学技术难以解析单细胞层面 PTM 动态调控的瓶颈。通过创新性地标记 36 种免疫细胞标志物与 4 类关键 PTM （乙酰化、乳酸化、泛素化、磷酸化），不仅揭示了 HBV 阳性肝细胞癌中髓系细胞磷酸化水平的整体下调现象，更基于 p-HSP27 、 p-STAT1 和 p-TRIM28 的磷酸化特征，首次鉴定了 M2 型巨噬细胞的四个功能亚型（ M2-P0 至 M2-P3 ）。这种多维度技术融合策略为肿瘤微环境研究提供了全新的方法，尤其在单细胞 PTM 分析领域树立了标杆 , 为其它癌种免疫微环境的单细胞 PTM 研究提供了借鉴。

研究发现的 M2-P2/P3 亚型展现出独特的免疫抑制特性，其高表达 LAG-3 、 PD-L1 等免疫检查点分子，并与 CD8+T 细胞的活化状态呈显著空间相关性。尤为重要的是，这两个亚型在免疫治疗高响应组中富集，且预测无进展生存期的效能超越传统生物标志物（如 PD-L1 表达水平）。这一发现不仅为筛选肝癌免疫治疗优势人群提供了潜在靶标，更提示靶向 M2-P2/P3 介导的“ Don't eat me” 信号网络（如 CD47/CD24 通路）可能重塑肿瘤免疫微环境，为克服免疫耐药提供新思路。值得注意的是，研究通过细胞邻域分析揭示的 CN2/CN3 区域免疫抑制极化现象，为理解肿瘤免疫编辑机制提供了空间生物学层面的重要证据。

综上，该研究展现出重要的临床转化潜力，为解析肿瘤免疫逃逸机制开辟了崭新视角，其整合单细胞多组学的分析范式将成为解析肿瘤微环境的重要手段。

专家点评

白凡（ 北京大学 国家杰青）

本研究首创性地整合质谱流式（ CyTOF ）、成像质谱流式（ IMC ）与质谱技术，建立了单细胞层面蛋白质翻译后修饰（ PTM ）的动态解析方案，突破了传统组学技术无法捕捉肿瘤微环境（ TME ）中 PTM 时空异质性的瓶颈。通过绘制 HBV 阳性肝癌的单细胞 PTM 图谱，团队首次发现髓系细胞磷酸化整体下调与肝癌进程的关联，并精准定位关键磷酸化蛋白（ p-HSP27 、 p-STAT1 、 p-TRIM28 ）在肿瘤相关巨噬细胞（ TAMs ）中的异常激活。这种多模态技术框架为 TME 研究提供了全新维度，有望成为解析免疫代谢微环境的核心工具。

研究基于磷酸化特征将 M2 型巨噬细胞划分为四个功能亚型（ P0-P3 ），其中 M2-P2/P3 亚型高表达 LAG-3 、 PD-L1 等免疫抑制分子，直接驱动免疫抑制性 TME 形成；空间分析揭示其周边 CD8⁺T 细胞呈现 " 活化但耗竭 " 状态，且对免疫检查点抑制剂（ ICIs ）敏感性显著提升；临床队列证实， M2-P2/P3 高浸润患者无进展生存期（ PFS ）显著延长，其预测免疫治疗疗效的能力超越 PD-L1 等传统标志物。这一发现为肝癌免疫治疗提供了精准分型依据和新型生物标志物。通过细胞邻域（ Cellular Neighborhood ）分析，研究首次发现 M2-P2/P3 富集区域（ CN2/CN3 ）存在独特的免疫代谢互作网络：肿瘤细胞高表达 " 别吃我 " 信号（ CD47/CD24 ），提示靶向吞噬检查点可能增强免疫疗效；该区域 T 细胞共表达多免疫检查点（ PD-L1/CTLA-4/LAG-3 ），表明联合阻断策略更具潜力。这种 " 磷酸化巨噬细胞亚型 - 空间免疫代谢微环境 - 治疗响应 " 三联特征的解析，为开发靶向 PTM 的联合免疫疗法奠定了科学基础。

总之，李咏生团队这项研究不仅开创了单细胞 PTM 组学技术体系，更通过磷酸化驱动的巨噬细胞新亚型鉴定，揭示了肝癌免疫抑制微环境的动态调控机制。其发现的 M2-P2/P3 亚型兼具预后预测价值与治疗靶点潜力，有望推动肝癌精准免疫治疗的临床实践变革。

原文链接：https://aacrjournals.org/cancerimmunolres/article-abstract/doi/10.1158/2326-6066.CIR-24-1298/762823/Single-cell-analysis-of-post-translational?redirectedFrom=fulltext

专家点评

王华（ 安徽医科大学 国家杰青）

肝癌免疫治疗虽 取得 重要进展，但整体疗效仍有限，其核心挑战源于肿瘤免疫微环境的复杂 抑制 机制 ，肝癌免疫 微环境的复杂性与异质性一直是 其 免疫治疗领域的核心挑战。重庆大学附属肿瘤医院李咏生团队的这项研究突破性地整合质谱流式细胞术（ CyTOF ）、质谱（ MS ）和成像质谱流式（ IMC ）技术，构建单细胞层面解析蛋白质翻译后修饰（ PTM ）的创新方法体系。该技术首次实现在单细胞精度下 进行 系统性描绘 HBV 阳性肝细胞癌（ HCC ）微环境中 PTM 景观，尤其是针对肿瘤浸润髓系细胞的磷酸化状态分析，揭示酪氨酸磷酸化水平下调与 HCC 进程的紧密关联。这种从 “ 宏观组学 ” 到 “ 单细胞分辨率 ” 的跨越，弥补传统转录组、蛋白组技术在细胞异质性解析中的局限，为精准刻画 肿瘤免疫微环境 动态网络提供了关键工具。

研究基于 p-HSP27 、 p-STAT1 和 p-TRIM28 三种磷酸化蛋白的表达特征，将 M2 型巨噬细胞精细划分为四个功能亚型，发现 M2-P1/P2/P3 亚型在肿瘤组织中富集，并高表达 LAG-3 、 PD-L1 等免疫抑制分子，证实其在构建免疫抑制性 TME 中的核心作用。值得关注的是，空间分析显示 M2-P2/P3 邻近的 CD8+ T 细胞虽呈现高免疫检查点分子表达，但同时伴有活化标志物升高，提示该区域可能是免疫治疗的 “ 潜力响应区 ” 。 进一步临床样本 结果 表明， M2-P2/P3 浸润水平与免疫治疗疗效及患者预后显著相关，其预测价值优于传统生物标志物。这一发现不仅深化 当前 对 HCC 免疫代谢微环境的认知，更通过单细胞 PTM 特征建立了全新的巨噬细胞分型体系，为开发兼具机制解析与临床预测价值的新型免疫治疗标志物提供了重要线索，有望推动 “ 精准免疫治疗 ” 在肝癌等难治性肿瘤中的应用突破。

制版人：十一

参考文献

1. Zhao H, Ren R, Zhang X, Zhan M, Cui J, et al. Single-cell analysis of post-translational modifications identifies immunosuppressive macrophage subtypes in the HBV-positive hepatocellular carcinoma microenvironment .Cancer Immunol Res2025, doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-24-1298.

2. Li W, Li F, Zhang X, Lin HK, and Xu C. Insights into the post-translational modification and its emerging role in shaping the tumor microenvironment.SigTransductTargetTher2021;6:422 .

3. Greten TF, Villanueva A, Korangy F, Ruf B, Yarchoan M, Ma L, et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma.Nat Rev Clin Oncol2023;20:780 -798.

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