Protein A的工程改造：用于优化抗体及 Fc 融合蛋白的纯化

抗体纯化

单克隆抗体（mAbs）如今已成为生物制药中最大的一类，且获得临床批准的治疗性单克隆抗体数量还在不断增加。为了治疗癌症和炎症性疾病等疾病，向体内注射单克隆抗体和片段结晶可（Fc）融合蛋白需要生产并纯化出大量具有极高纯度的蛋白质。在单克隆抗体的上游生产过程中，会得到一种含有宿主细胞蛋白（HCPs）、DNA 和病毒等杂质的复杂混合物。

为了在下游分离免疫球蛋白G（IgG）抗体和Fc融合蛋白，已经开发出多种分离技术。所使用的方法可分为色谱法和非色谱法。历史上，非色谱法，例如结晶、沉淀和两相水分配等方法较为少见。色谱法，包括离子交换色谱和基于细菌表面蛋白与抗体保守区域结合的亲和色谱，通常在实验室规模以及工业规模分离中被广泛使用。离子交换色谱在经济上更具合理性，但其选择性低于更广泛使用的基于亲和力的策略，后者因此占据了主导地位。

相比之下，离子交换色谱通常被用作亲和色谱单元操作下游的抛光步骤。最完善的亲和色谱法是基于金黄色葡萄球菌蛋白A，这种亲和配体能够提供出色的回收率和纯度。尽管蛋白A亲和介质取得了成功应用，但由于蛋白类色谱材料成本较高，人们仍在努力开发非色谱法，但收效甚微。因此，蛋白A仍然是单克隆抗体纯化的黄金标准，新的改进型蛋白A填料不断推出，以满足日益增长的需求。

抗体结合蛋白

有几种天然存在于细菌表面的抗体结合蛋白可用于抗体纯化。其中，蛋白A是最常用的一种，将在下一部分详细介绍。除了蛋白A，还有链球菌蛋白G，其优势在于能够结合所有IgG亚类，包括例如小鼠IgG1、人IgG3以及大鼠IgG2a和b，而这些亚类与蛋白A的结合力较弱或根本无法结合。此外，蛋白G能够结合IgG的Fc和片段抗原结合（Fab）部分，这两种情况下都是与重链的恒定区结合。因此，蛋白G可用于纯化蛋白A对其无或低亲和力的特定IgG亚类/同种型，以及某些蛋白A不是选择的抗体片段。粪肠球菌蛋白L能够结合某些κ轻链的可变部分，因此也可用于纯化抗体，包括全长抗体以及含有兼容κ轻链的Fab和单链可变片段等片段。此外，还有重组融合蛋白产品，例如蛋白A/G、蛋白LG和蛋白LA，它们结合了蛋白A、G和L的结合域，旨在扩大结合特异性，使更多亚类的纯化成为可能，同时也适用于那些抗体亚类未知的样品。

金黄色葡萄球菌蛋白A

蛋白A存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁上，被认为通过各种机制增加了细菌的毒性。其中一种机制是通过结合IgG的恒定部分，位于Fc的CH2和CH3结构域之间。通过这种方式，细菌能够避免调理作用，逃避吞噬作用，从而在体内停留更长时间。蛋白A还被证明能够结合某些B细胞表面的VH3家族抗体Fab片段的VH结构域，从而触发这些细胞的凋亡，对免疫系统产生削弱作用。

金黄色葡萄球菌蛋白A包含五个高度同源的结构域，E、D、A、B和C，每个结构域由56-58个氨基酸组成（图2.1A）。所有五个结构域都折叠成紧密堆积的三螺旋束，具有强大的疏水核心，其中由螺旋一和二形成的表面负责Fc结合（图2.1B）。

通过两次突变，将蛋白A的B结构域改造成了Z结构域：Ala1Val用于克隆目的，Gly29Ala使蛋白对羟胺处理的敏感性降低。后者的目的是使该结构域在用作纯化标签时能够与位点特异性切割相兼容。这一突变的一个后果是失去了对含有VH3的IgG的可变区域以及较小的抗原结合片段的结合能力。从那时起，为了改进蛋白A结构域在抗体纯化中的应用，对其不同结构域进行了大量改造，在接下来的部分中将通过选定的例子加以说明。图2.1C展示了五个天然蛋白A结构域以及Z结构域的氨基酸序列比对。

基于蛋白A的纯化

基于蛋白A的亲和色谱法是在纯化抗体和Fc融合蛋白时最常用的捕获步骤。2016年有报道称，在单克隆抗体的FDA申报中有86%使用了这种方法。作为纯化装置中的初始捕获步骤，它提供了一个便捷的纯化步骤，能够获得高纯度、高浓度的产品，回收率高达99%，有效去除HCPs和DNA，以及病毒清除，之后只需要进行一些抛光步骤，即可获得足够用于临床目的的抗体。此外，蛋白A基色谱法填料本身对酸性pH、尿素或盐酸胍等变性剂以及较低浓度的氢氧化钠具有很高的耐受性，使得蛋白A基色谱法填料能够承受更温和的原位清洗（CIP）程序 。自首次推出以来，蛋白A填料在容量、生产力和销售方面都有稳步增长。市场上的大多数蛋白A填料都是基于全长重组蛋白A或由四个到六个B或C结构域（或其改性版本）组成的多聚体蛋白。市场上的众多蛋白A基产品大多是色谱基质，其中蛋白被固定在琼脂糖、多孔玻璃或聚甲基丙烯酸酯珠子等材料上。尽管这些基质功能良好且已经得到广泛应用，但它们存在流速受限的缺点，这是由于固体载体孔隙中的扩散导致的背压，此外还需要在应用前对样品进行过滤，以避免基质堵塞和污染。有一些替代品不是基于珠子载体，例如单块亲和色谱和膜吸附剂，它们允许更高的流速和更低的背压，从而避免了珠子基色谱介质的一些问题。然而，到目前为止，它们的低容量和仅在小规模可用性尚未得到改善，以满足大规模纯化的需求。
尽管蛋白A亲和色谱法具有无与伦比的特异性和效率，但大量的工程改造工作表明，蛋白A的结构域可以根据特定需求进行定制。一个主要关注点是蛋白A基填料的性能随时间的下降，这被认为是由蛋白类物质对填料的污染或在用于清洗的碱性条件下配体降解所导致的。其他工作则针对低pH洗脱的要求，这可能会对纯化后的蛋白产生负面影响，并研究了例如改变配体的结合特异性或稳定性如何能够实现更温和的洗脱条件。基于定点突变、末端截短或插入等策略成功地产生了改进的蛋白A衍生结构域，可用于以多聚体色谱配体的形式用于抗体纯化。理想的改进型亲和填料应具有更高的结合容量、更长的使用寿命、更好的碱稳定性或更佳的洗脱行为。

蛋白A结构域的工程改造以增强碱稳定性

蛋白A初级序列的早期工程改造工作集中在提高其化学稳定性上，这与其最初作为亲和融合标签的使用有关。这些工作以蛋白A的B结构域为模板设计了合成的Z结构域，该结构域可以被视为蛋白A五个结构域的共识序列（图2.1C）。这种工程改造工作以及对蛋白A衍生结构域的全面结构调查对于进一步开发新型蛋白A基纯化基质具有重要意义。

提高对苛刻清洗条件的耐受性可以使昂贵的填料在工业应用中重复使用更多次，这一直是改进配体性能的驱动力。如今高度优化的填料可以在50-200个产品周期中使用。最近对十二种商业化的蛋白A固定相进行全面评估表明，存在几种稳健的选择，其中配体经过工程改造，与野生型蛋白相比性能有所提高。碱稳定化通常通过合理、定点突变来实现。由于其三螺旋构象和疏水核心，野生型蛋白A在极端pH条件和暴露于尿素等变性剂下已经相对稳定。氢氧化钠的耐受性尤其相关，因为它是一种用于色谱填料原位清洗的首选清洗剂。它能有效溶解脂质、蛋白质和核酸，并使吸附在色谱基质上的物质解吸。氢氧化钠还可以灭活微生物、破坏内毒素，价格低廉且易于监测和去除。

早期研究表明，野生型蛋白A在用0.5 M NaOH处理15分钟后仍保持约99%的结合容量，对于蛋白基试剂来说这是相当可观的，但仍然不足以在稳健且要求苛刻的工业应用中重复使用。在高pH条件下最易受到影响的残基是天冬酰胺，因为它倾向于发生脱酰胺或在高pH下加速的主链断裂反应。谷氨酰胺也被认为对高pH有一定的敏感性，但远低于天冬酰胺。

在设计Z结构域以使其对羟胺切割稳定时，同时通过Gly29Ala替换移除了一个特别易受碱影响的Asn28-Gly29基序。然而，Z结构域含有八个天冬酰胺残基，主要的蛋白工程工作集中在将这些残基替换为其他残基，以获得更耐碱的变体。给定残基对修饰的敏感性取决于序列和构象，因此不仅难以预测，而且难以在已经相对稳定的蛋白A序列背景下进行测量。大多数工程工作都是基于与现有的蛋白A基结构域或多聚体亲和配体的相对经验比较。天冬酰胺残基对碱敏感性的重要性通过蛋白A结构域的第23位残基得以体现。除了C结构域是苏氨酸外，所有结构域在该位置都有一个天冬酰胺残基。这使得C结构域成为所有野生型蛋白A结构域中耐碱性最高的。C结构域固有的碱稳定性启发了其在多聚体形式中用于抗体纯化的应用。

对Z结构域中的八个天冬酰胺中的七个进行系统评估表明，替换Asn23对增加碱耐受性最为有益。由于其位于接近N端的无结构区域，且该区域在多聚体配体中可以轻松重新设计，因此未包括天冬酰胺3。这项研究基于绕过突变策略，使用了结构上不稳定的Z结构域变体（Phe30Ala），以便更容易地检测出使用更稳定模板结构域时难以测量的微小稳定性差异。一般来说，只观察到对亲和力有轻微影响，对二级结构含量没有明显影响。

通过监测一系列突变体在连续15次IgG纯化循环中的结合容量，这些Z结构域变体被固定在填料上，并在每次运行之间使用30分钟0.5 M NaOH清洗方案。数据显示，Asn6、Asn11、Asn43和Asn52残基对碱依赖的结合容量损失并不重要，因为它们的表现与单独的Phe30Ala突变体相似。一个可能的解释是它们位于或靠近螺旋区域，这些区域的灵活性较低，因此不易受到修饰。

然而，Asn43Glu与IgG结合能力的降低有关，这一结果在后来的一份报告中被提及，这表明需要考虑不同参数之间的复杂相互作用。Asn23Thr突变体与单独的Phe30Ala相比显示出最显著的改进，这种特定的替换也已被证明可以增加Z结构域的稳定性，尽管以对IgG结合能力的轻微降低为代价。在基于Z结构域的工程结合蛋白（称为affibody分子）的优化结构框架中，Asn23Thr通常与Asn3Ala和Asn6Ala结合使用（图2.2A），后两者主要与增加储存稳定性和降低侧链修饰风险有关。与Asn23Thr不同，Asn21Ala替换导致在与对照Phe30Ala相比的碱暴露后结合容量明显下降。Asn21变体的不良表现表明，这个位置需要特别关注，其敏感性可能归因于其位于一个暴露的环状区域，而不是其侧链的化学组成。

总的来说，这些研究表明，有几种结构上兼容的替换可供考虑，共识设计方法非常适合合理工程目的。例如，关注组氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等残基，这些残基在野生型序列中代表天冬酰胺的替换，已被用来构建一个耐碱的四聚体Z结构域变体，携带Asn3His、Asn6Asp和Asn23Ser替换。有趣的是，也有例子表明，非天冬酰胺残基的替换被证明可以进一步增强碱抵抗力，例如，C结构域中Gly29Trp修饰的域比Gly29Ala具有更强的耐碱性。

在基于蛋白A的色谱法中实现更温和的洗脱条件

尽管蛋白A纯化具有出色的特性，并且被广泛用于IgG和Fc融合蛋白纯化过程中的初始捕获，但为了洗脱而需要打破蛋白A与抗体之间的强相互作用所需的酸性pH是一个主要缺点。通常使用柠檬酸、甘氨酸或醋酸缓冲液在pH约为3.5的条件下从蛋白A柱中洗脱IgG。低pH可能导致抗体聚集，这是一个问题，因为聚集可能导致蛋白失活或引发免疫反应，因此需要将其降至最低限度。有多个报告涉及该主题，表明低pH暴露是抗体和Fc融合蛋白聚集的关键决定因素。不同抗体之间的聚集程度有所不同，某些亚类，如IgG4和IgG2，据报道比其他亚类（例如IgG1）更容易聚集，而IgG1似乎更容易降解。尽管IgG1是目前用于治疗性抗体的最常用亚类，但也有基于IgG2和IgG4的获批疗法。

研究表明，使用蛋白A进行酸性洗脱的纯化过程比仅使抗体暴露于低pH环境会加速抗体聚集。此外，据报道增加盐浓度会进一步增加聚集。关于缓冲剂的作用，已有不同的数据呈现，其中在一个案例中，柠檬酸被报道比醋酸和甘氨酸导致更高的聚集率，而另一项研究则表明，缓冲剂的浓度而不是缓冲剂本身是蛋白质聚集的主要贡献因素。

此外，据报道中和步骤中所用碱的种类对聚集程度也很重要。此外，洗脱后的高温暴露也可能影响聚集，这解释了为什么限制洗脱池在高温下的保持时间很重要。对于某些抗体，尤其是酸敏感的Fc融合蛋白，这些问题可能会排除蛋白A色谱法作为纯化的选项。因此，大量的研究工作致力于蛋白A结构域的工程改造，以及寻找替代的洗脱缓冲液组成，以提高从蛋白A基填料所需的洗脱pH。

值得一提的是，低pH并非只有负面影响，它通常被包含在纯化过程中作为病毒灭活步骤。病毒去除确实是生物治疗药物纯化过程中的一个重要部分，如前所述，也有报告声称实际的色谱步骤，而不仅仅是低pH本身，对聚集率有影响。在这种情况下，温和洗脱后的低pH保持可能是病毒灭活的替代方案，同时避免蛋白质聚集。如果整个纯化过程中要避免低pH，则可以通过病毒过滤、阴离子交换色谱或使用洗涤剂等替代方法进行病毒清除。

已经描述了多种方法来改善蛋白A色谱法中的洗脱条件，这有望扩大蛋白A纯化在对酸更敏感的抗体以及含有Fc的蛋白质中的应用范围。

洗脱缓冲液添加剂以实现更温和的洗脱

一种增加洗脱缓冲液中目标蛋白洗脱pH或降低聚集倾向的方法是使用添加剂。精氨酸是一种常见的蛋白质复性促进剂，将0.5-2 M精氨酸或其衍生物乙酰精氨酸和精氨酸胺分别添加到洗脱缓冲液中，已被提议可以将洗脱pH提高到4-4.3。其他建议的添加剂是1 M尿素，据报道可以减少聚集，但在报道的案例中对洗脱捕获抗体所需的pH没有影响。Ejima等人表明，添加1-2 M盐酸胍可以将洗脱所需的pH提高到4.3。然而，洗脱产品显示出聚集，与低pH洗脱后的聚集量相似。还评估了其他氨基酸作为添加剂，如赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸是否可以改善洗脱pH，但这些氨基酸对洗脱抗体所需的pH没有影响。

此外，添加丙二醇被认为可以积极影响聚集率，但据报道反而增加了一种特定Fc融合蛋白的聚集含量。从上面的例子可以看出，改变缓冲液组成可以在纯化过程中对洗脱pH和/或聚集率产生影响，但效果可能难以预测。虽然这些不同的添加剂可能对某些聚集倾向的抗体或Fc融合蛋白的纯化有益，但效果可能因要纯化的蛋白质而异，需要针对每个纯化过程进行评估。尽管已证明精氨酸添加可以提高洗脱所需的pH，但高达2 M的浓度在大规模纯化过程中将非常昂贵。

结构工程以改善洗脱

由于蛋白A与IgG之间的高亲和力相互作用，可能通过降低这种亲和力来改变从蛋白A填料洗脱抗体所需的低pH。Gly29残基已被证明参与与含有VH3的抗体可变域的相互作用，并且当替换为丙氨酸时，可显著降低Fab结合。这种效应是使用基于Z结构域而非野生型蛋白A的配体的常见论据的基础，因为缺乏对可变区域的结合使得在略高的pH下实现更均匀的洗脱成为可能。因此，已经探索了Gly29的几种替换，以进一步降低Fab结合；特别关注Gly29Lys、Gly29Arg和Gly29Leu。为了扩大Z结构域衍生配体相对于野生型蛋白A的优势，通过在固有耐碱的C结构域模板中结合Gly29Ala、Ser33Glu和Asp36Arg替换，计算设计了合理突变体，以进一步降低VH3结合。

对结合界面的这种微妙修饰可用于修改柱洗脱条件。此外，已经证明两种变体的四聚体配体用于MabSelect Sure™基质允许在比使用原始结构域时高出约0.5个pH单位的pH下洗脱。在第一个版本中评估了His18Ser，在第二个版本中也包括了Asn28Ala，这两种突变都针对B/Z结构域与Fc结合的位置。这个例子再次表明，对配体进行微小修饰可以在保持产量的同时实现工艺改进。

为了在蛋白A纯化中实现更温和的洗脱，已经进行了更广泛的工程工作。使用蛋白A结构域的截短变体是允许在更高pH下洗脱的早期方法。一种合理的方法是通过在结合位点引入组氨酸残基，在降低pH时电静力干扰Fc内的残基。Tsukamoto等人报道了一个有希望的例子，其中B结构域的一个变体携带Asp36His替换，在pH 5.0时与野生型B结构域相比对IgG的亲和力降低了100倍，从而允许在更高的pH下洗脱。

Koguma等人介绍了一种蛋白A的B结构域变体，在其中引入了突变，以降低结构域内部氨基酸侧链的疏水性，从而降低了整体稳定性。这是通过将位于19和22位的亮氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸来实现的。此外，该分子还包括Z结构域中存在的Gly29Ala突变（图2.2B）。这些突变使蛋白结构域依赖温度，使得IgG可以在低于10°C的温度下结合，并在将温度提高到40°C时释放。尽管这种发明有望实现中性pH下洗脱抗体，但需要将温度提高到40°C可能并不理想，这不仅是因为产品在高温下可能不稳定，而且在大规模过程中进行这样的温度升高也不方便。作为一种替代方法，也可以使用1 M NaCl脉冲进行洗脱，这可能是大规模过程中洗脱的更好途径，而不是提高温度。

环工程

一些努力集中在蛋白A结构域的环工程上。Reiersen和Rees使用了一个基于B结构域的微结构域，只包含通过二硫键稳定的螺旋1和2。连接螺旋的环（HDPNLN，残基19-24在1zda.pdb中）被替换为源自典型弹性蛋白转角的序列（GVPGVG）（图2.2C）。这导致了一种蛋白变体，可以在室温下结合IgG，并允许在低温下洗脱，或者通过用水从柱子上移除盐来洗脱，因为工程化的微结构域在硫酸钠存在下显示出盐诱导的折叠。最近的应用已经证明了使用各种设计的刺激响应性弹性蛋白样多肽与Z结构域或Z结构域二聚体融合进行抗体亲和沉淀。这种方法展示了一种绕过传统色谱方法以实现更经济的抗体纯化的替代方案。尽管前景广阔，但这些方法目前尚未在工业中广泛使用。

其他工作则专注于工程化Z结构域中的另一个环，即位于螺旋二和三之间的四个氨基酸环（DPSQ，残基37-40在共识序列中（图2.1C））（图2.2D）。通过将该环延长六个甘氨酸残基，或用甘氨酸替换这四个残基，Gülich等人能够使结构域不稳定，从而降低对IgG的亲和力。这使得可以从连接到工程化结构域的柱子上在pH 4.5下洗脱IgG，即比传统蛋白A色谱法中使用的酸性程度低十倍。

Kanje等人采用了另一种工程方法，利用EF-hand环的钙协调特性，使Z结构域依赖钙来结合IgG。基于天然EF-hand基序序列的钙结合环库被引入，以替换螺旋二和三之间的DPSQ环，同时对已知对疏水核心重要的位置进行随机化。通过噬菌体展示选择和易错PCR，开发了一种对IgG具有钙依赖性结合的Z结构域变体，命名为ZCa。这个结构域有一个由12个氨基酸组成的环，以与典型EF-hand环相同的方式协调钙（图2.2E），并且以类似于其亲本结构域的方式与IgG结合。

此外，除了引入的环外，ZCa在已知与Fc相互作用的位置上有几个替换（Phe5Leu、Asn28Lys和Lys35Ile），以及替换Gln55Arg，这个位置被认为可以形成分子内氢键。这种蛋白变体已被证明可以在pH 5.5下以钙依赖的方式释放多克隆人IgG，通过使用EDTA耗尽结合的钙离子。新型ZCa基质被证明在饱和时具有与相当的亲本Z结构域基质相似的结合容量。最近的数据表明，ZCa可以被多聚化，并且在5分钟停留时间下，该分子的动态结合容量随着多聚化而增加。值得注意的是，四聚体ZCa允许在中性pH下洗脱IgG2和IgG4。然而，需要进一步研究该结构域对CIP处理的改进，因为目前该分子并不像其他优化的蛋白A变体那样耐碱。

尽管如此，这个结构域对于酸敏感的Fc融合蛋白非常有前景，现在可以在更高的甚至中性洗脱pH下纯化，同时保持亲本Z结构域在特异性和结合容量方面的优良特性。

提高蛋白A填料的结合容量

由于治疗性单克隆抗体用于治疗各种疾病，且患者群体庞大，需要反复使用所需的药物，因此需要实现大量产品数量目标。上游处理的持续改进，如优化培养基、细胞喂养策略以及最重要的合适细胞系的选择，多年来已显著提高了单克隆抗体的表达水平。因此，为了处理更高的细胞培养滴度，下游提高生产力的方法也已得到开发。为了优化昂贵但关键的蛋白A色谱步骤，重点放在提高蛋白A填料的结合容量上。

自20世纪70年代首次使用蛋白A介质以来，取得了巨大进展，近年来随着各种制造商推出更先进的蛋白A填料，动态结合容量（DBCs）显著增加。高容量填料有可能减少缓冲液消耗，最小化柱子尺寸，并减少宝贵的蛋白A介质的使用量，这可能对工艺经济性产生重大影响。因此，目前对大量单克隆抗体的需求可以更容易地以更实惠的价格实现。

提高结合容量的方法包括选择偶联化学、配体多聚化和其他间隔技术，以及调整配体密度和颗粒/孔径大小。前面提到的因素可以影响色谱填料的静态结合容量或动态结合容量，或者最终两者都有。静态结合容量是衡量填料在不考虑任何过量蛋白质损失的情况下能够结合的最大蛋白质量的指标。在操作条件下，在一定蛋白质突破之前测量的DBC考虑了流速，因此与色谱支持相关的质量传递特性有关。因此，静态结合容量永远不会低于DBC，但在大多数情况下要高得多，因为存在质量传递限制。

基质和配体密度

基质的物理性质，如颗粒大小的修改，通常由制造商采用，但在这里只简要提及。减小颗粒大小已被证明对DBC有显著影响，通过提供更快的质量传递，尽管必须考虑到由此产生的更大的压力降。另一个通常被改变以实现更高DBC值的一般材料属性是孔径大小。通过增加孔径大小，可以增加抗体结合发生的可用空间，并最小化立体阻碍。在抗体纯化的情况下，这一点尤为重要，因为抗体是大分子，孔扩散率低。然而，较大的孔径会减少总填料表面积，从而导致静态结合容量降低。

在GE Healthcare的MabSelect Xtra™填料中，与早期的MabSelect™相比，孔径大小增加，通过增加配体密度来抵消静态结合容量的损失。自然地，增加固定在填料上的蛋白A配体密度会导致静态结合容量增加，尽管只能达到一定限度，之后分子间立体效应会阻碍进一步的容量增加。Ghose等人表明，由于相邻配体在接近商业配体密度时的立体效应，可以使用显著低于商业基质通常使用的配体密度来实现相同的静态结合容量。基于与MabSelect SuRe™相同的耐碱配体的高配体密度填料MabSelect SuRe™ LX，也被认为会引起严重的配体间立体效应，影响结合容量。这些填料的配体利用率大幅降低，可能对工艺经济性产生负面影响。

配体多聚化

除了对配体附着的基质进行修改以及附着在表面上的配体数量外，对蛋白A配体本身的工程改造对结合容量产生了重大影响。为了提供更多的抗体结合位点，将多个蛋白A结构域连接起来形成更长的配体已成为提高填料结合容量的常用工具。这些额外的结合位点已被证明可以增加静态结合容量，至少在B结构域八聚体的情况下是如此。在溶液中，Freiherr von Roman和Berensmeier研究了单个配体的抗体结合结构域数量与其结合性能之间的关系时，发现B结构域九聚体显示出最有希望的结果。

从二聚体到九聚体，当配体未固定在固体支持上时，观察到配体与抗体结合性能之间存在相当线性的依赖关系。然而，溶液中的测量并不能反映蛋白A色谱法的真实条件。在丙烯酰胺基固定相上，每种位点特异性固定配体的重复结构域数量达到最大配体密度，随后对于更高阶的多聚体，配体密度下降，这很可能是由于增加的立体阻碍。在这种情况下，与八聚体相比，九聚体配体的配体密度大幅降低，导致静态结合容量和DBC均降低，使八聚体成为该色谱支持上抗体纯化的最有希望的候选者。即使针对这些特定填料优化了配体密度，由于非九聚体是他们能够成功生产和纯化的最大配体，因此不太可能观察到重大的容量增加。

由于配体多聚化对DBC产生的积极影响，也可能是因为配体的延伸长度可以作为色谱支持的间隔。除了提供更多的结合位点外，配体对抗体结合更加可及，这可能有助于在纯化过程中进行质量传递。然而，对于长多聚体配体，可能需要更长的停留时间，才能观察到DBC的最大差异。

最近，仅增加可及性就被认为会影响一些配体的结合容量，当比较前面描述的带有钙结合环的Z结构域的多聚体变体时，使用表面等离子体共振进行比较。二聚体和三聚体之间的结合容量差异较大，可以用额外的功能位点来解释，而单体与二聚体以及三聚体与四聚体之间的较小容量差异表明，额外的结构域无法结合另一个抗体分子，而是可能更具可及性并减少质量传递阻力，从而允许抗体结合到更多配体。这种推理得到了几项研究的支持，这些研究表明，即使在溶液中，蛋白A的五个结构域也无法同时结合一个抗体。分子内立体效应似乎阻止了一些结构域的同步结合，因此在开发蛋白A色谱填料时，这也是需要考虑的一个因素。

优化连接区域

为了防止配体内的立体效应，并实现更接近静态结合容量的DBC值，可以通过在多聚体蛋白的结构域之间引入连接区域来优化配体结合位点的灵活性和可及性。Hober和Johansson等人建议连接长度范围为零到15个氨基酸。

因此，两个结构域的N端和C端可以直接连接，或者通过一定数量的氨基酸隔开，这些氨基酸的选择应谨慎进行，以避免蛋白不稳定。由于其独特的结构和在蛋白中形成转角的能力，脯氨酸不应包含在内，以保持灵活性。例如，Björkman和Rodrigo展示了将Z结构域和蛋白A中存在的C端脯氨酸（Pro57）替换为异亮氨酸的效果。

由于各个结构域的灵活性增加，因此获得了更高的DBC。Freiherr von Roman和Berensmeier在研究一系列多聚体蛋白A配体时，保留了脯氨酸，但在结构域之间使用异亮氨酸作为氨基酸连接区域。一般来说，引入配体的长氨基酸序列应评估其对可能存在于样品中的蛋白酶的敏感性。在选择连接区域时，还应考虑对填料的碱稳定性的影响，例如排除天冬酰胺和谷氨酰胺等易受碱影响的残基。

多聚体配体可能不仅带来优势，也可能带来一些问题。除了DBC之外，蛋白A色谱法的其他关键方面，例如纯度和回收率，可能会受到更长多聚体配体的较大表面积的影响，这也会创造更多非特异性相互作用的位点。一些具有更高结合容量的填料在减少宿主细胞蛋白（HCPs）等杂质方面已被观察到效率较低。

然而，在最近的一项研究中，Müller和Vajda比较了Tosoh的两种蛋白A填料，一种带有四聚体配体，另一种带有六聚体配体，在HCP去除和回收方面没有观察到显著差异 [95]。Pabst等人也观察到，对于具有不同结合容量的多种蛋白A固定相，HCP水平相当一致。然而，对于每种固定相，根据纯化的单克隆抗体的不同，观察到HCP水平存在差异。

配体偶联

为了进一步增强色谱配体的可及性并提高DBC，可以优化配体与基质的偶联。将重组蛋白A配体偶联到基质上有多种方法。对于早期的蛋白A固定相，配体通常通过胺偶联共价固定在基质上。利用伯氨基将配体固定在基质上会导致异质固定，存在降低结合位点在固定位置的可及性的风险。从那时起，定向配体固定而非随机偶联已被证明可以提高结合容量。利用末端半胱氨酸残基的位点特异性偶联化学已被证明是一种高效且高度可重复的策略，目前被制造商广泛使用。

半胱氨酸是一种独特的氨基酸，其侧链巯基可以形成稳定的硫醚键或二硫键。半胱氨酸可以放在蛋白的N端或C端，单独使用或与短连接区域结合，以作为从树脂骨架的间隔，以促进偶联反应，并可能增加配体的流动性和可及性。连接区域应具有与配体相似的耐碱性。

早在1989年，就研究了通过半胱氨酸作为19个氨基酸连接区域的一部分，在Z结构域的C端进行定向固定，并显示出与当时的商业野生型蛋白A填料相似的结合容量，尽管该研究中的配体密度低了十倍。将半胱氨酸放在C端特别有用，可以获得功能活性配体，因为成功固定的配体将是全长的。关于连接区域的氨基酸选择，Ander等人建议使用赖氨酸和组氨酸残基。Freiherr von Roman和Berensmeier在通过硫醇化学将蛋白A的B结构域的多聚体版本固定在固体支持上时，在C端加入了Lys-Cys-Lys标签，并与没有半胱氨酸的相同配体进行了比较。对于六聚体，通过位点定向偶联，静态结合容量增加了高达41%。对于八聚体，观察到较小的增加，这可能是由于结合容量已经接近理论最大值。将带有半胱氨酸的配体固定到树脂表面的方法利用了多种不同的硫醇反应性化学基团，如马来酰亚胺或环氧基团。进一步探索了增加蛋白A配体与固定相之间的距离并提高配体可用性的方法。最近，一种结合了位点特异性硫醇固定和接枝琼脂糖基质的右旋糖酐，显示出比非接枝介质更高的结合容量。

综上所述，配体聚合和位点定向偶联化学的结合是制造商提高蛋白A配体结合容量的既定方法。然而，重要的是要记住，结合容量取决于要纯化的蛋白质以及用于纯化的条件。例如，与单克隆抗体相比，分子量较低但具有相同Fc结构域的Fc融合蛋白在相同的蛋白A填料上始终显示出较低的结合容量。

在生物制药生产中，通常使用相同的蛋白A固定相纯化一系列治疗性单克隆抗体和Fc融合蛋白，以简化工艺开发。这种方法存在产品损失的风险，因为使用蛋白A介质的纯化过程通常在接近指定结合容量的条件下运行，以最小化填料成本。无论声明的结合容量如何，都应选择并评估特定应用的蛋白A填料。此外，高DBC并不是高效纯化过程的唯一因素，因为不同的停留时间也在工艺生产力中发挥作用。

总结

基于蛋白A的亲和色谱法长期以来一直是工业抗体和Fc融合蛋白纯化中最常用的方法。因此，人们一直对理解和改进蛋白A及其基质以实现更好的性能和更长的使用寿命表现出浓厚的兴趣。在本章中，我们描述了一些为开发和理解蛋白A及其一些IgG结合结构域所做的努力。

工业中使用的亲和基质的一个重要特点是其在使用环境中的高稳定性。对于蛋白A而言，这包括对蛋白酶的抵抗力、耐碱性和耐受低pH的能力。由于蛋白A的高构象稳定性，其固有的对不同苛刻条件的耐受性已经相当高。尽管如此，仍对更耐碱的蛋白配体有需求，以便在保持基质长寿命的同时安全地进行CIP。这促使了对一系列新变体的进一步且非常成功的开发，这些新变体显示出比原始蛋白更高的耐碱性。

此外，从蛋白A基质洗脱结合的抗体或Fc融合蛋白所需的低pH可能会因活性丧失和/或聚集形成而对目标蛋白产生不利影响。因此，已经采取了多种方法以允许更温和、更高pH的洗脱。在洗脱缓冲液中评估了不同的添加剂，结果各异。此外，对蛋白A结构域进行了各种工程改造，以减少蛋白A色谱法中洗脱条件的苛刻性。这是通过在亲和配体的结合位点或其疏水核心中引入突变，或通过环工程使结构域不稳定来实现更高pH下的洗脱。

另一个重要特点是色谱填料在操作条件下的所需停留时间、允许的流速和结合容量。为了实现最佳的填料性能，人们投入了大量精力来开发填料及其属性，以及将蛋白配体共价连接到填料上的方法。此外，还研究了填料表面的蛋白密度，以在不引起洗脱步骤中沉淀的情况下实现最高的结合容量。此外，还研究了相互连接的IgG结合结构域的数量以及它们之间的间隔长度。在这里，重要的是实现足够的灵活性以实现最佳结合，同时不引入对蛋白酶或极端pH敏感的弱点。

总之，为了改进抗体和Fc融合蛋白的纯化，已经设计出了许多创新的方法来工程改造具有改进特性的新型蛋白A变体。其中一些方法取得了成功，并导致了一系列新产品的上市。尽管如此，我们预计开发新型蛋白A替代品以进一步增强其属性的工作将继续进行，并且未来将探索新的创新方法。

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