摘要：

为了实现iPSC衍生疗法的工业化，有必要解决围绕在制造过程中实施的分析的现有挑战，以评估和监测细胞扩增、分化和最终产品的质量。在本文回顾总结了一些关键的分析方法，这些方法用作过程或最终产品放行测试的鉴定、效力或安全性的一部分，并强调了基于iPSC的疗法的化学、制造和控制（CMC）策略中需要考虑的挑战和潜在解决方案。

与基于iPSC的产品的表征和测试相关的一些挑战与分析技术的选择（以确保适用性）、分析可靠性和稳定性有关。可能需要分析方法的自动化，以减少手动作时间，并通过减少分析变异性来提高方法的可靠性。事实上，我们已经证明分析方法的自动化是可行的（使用基于ELISA的分析进行评估），并且与手动运行的分析相比，将导致更精确的测量（通过较低的变异和标准偏差的系数来证明）、更少的手动作时间和快速。因此，为了支持基于iPSC的疗法的商业化，本文建议在开发阶段建立精心设计的测试策略，同时在制造过程中结合稳健、可重复、可靠且可能自动化的分析。

1.引言

为了建立稳健且商业上可行的GMP合规过程，确定与关键过程参数（CPP）相关的关键质量属性（CQA）至关重要。为了实现iPSC生产过程的这一目标，需要一个分析方法库，考虑一组专注于中间体或最终产品的特性、安全性、纯度和活力的放行测试，以及旨在生成数据库以监测培养物中表型细胞特征变化的额外表征分析。某些最终用户可能会要求与制造批次相关的其他规格，以证明适合银行的用途。此外，额外的表征分析可以被视为仅供参考（FIO），旨在用作过程监测或更好地了解所生产的批次（图1和表1）。

表1.常见放行和表征检测：总结了GMP放行检测的一般范围，以及应用于这些iPSC库的其他表征

分析方法不仅需要用于最终产品的质量控制（QC），还需要用于早期临床和最终商业阶段的制造过程表征。随着细胞治疗领域的扩展，高度手动的iPSC生成过程的工业化在很大程度上取决于在制造过程中实施高度稳健和可靠的分析方法。特别是，下一代iPSC工艺将需要整合自动化工作流，将自动分析与自动扩增或基于反应器的细胞培养系统集成。过程分析、控制策略和自动化之间的交互将是该领域令人兴奋的发展。本文旨在强调当前用于iPSC放行和表征的检测中的差距和挑战，确定检测是否是放行或FIO所必需的，新一代检测的开发或数据分析的挑战，对自动化分析方法的需求，以及进一步将分析整合到iPSC制造过程中如何帮助更快的产品发布并确定用于产品表征的下一代检测。

2.iPSC检测优化和稳健性的需求

细胞治疗药物产品定量分析改进的一个关键驱动力是生物分析科学的进步，包括技术和方法学。随着检测方法的开发，需要根据一致的检测结果来指定对可接受检测性能的期望。这些规格是在分析优化阶段通过一系列参数读取建立的。在优化研究期间评估和优化的参数包括（i）特异性、（ii）线性、（iii）准确度和（iv）精密度。检测的特异性是区分阳性对照和阴性对照的能力。例如，流式细胞术检测应该能够检测相同标志物的阳性细胞群和阴性细胞群。OCT4和NANOG是必需的多能性标志物，选择特异性的细胞系对这些标志物将是阴性的。阳性对照或系统适用性对照应包括对OCT4和NANOG标志物呈阳性的细胞系，因此此类细胞系对这些iPSC标志物具有特异性。测定的线性将确定给定产品的测定的线性范围。例如，建立细胞计数和活力法的线性是为了了解药品细胞计数的线性范围。这将有助于确定产品的稀释度，以便在线性范围内测量细胞计数。总之，准确度将决定产生可接受产品回收率的分析范围，并且应在分析程序的指定范围内确定。例如，用于酶联免疫测定（ELISA）的分析物加标应能够准确捕获读数中的加标百分比，从而指示回收率。未能在给定范围内回收加标分析物将导致分析不可靠，并且无法通过研究的准确性。线性和准确度属性有助于确定定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）。Precision评估检测的可接受变异性，这有助于了解是否需要进一步优化检测以及进一步优化检测的途径。

通过计算分析内精密度（分析中存在的变异性量）、批间精密度（单日实验中存在的变异量）和中等分析精密度（所有日期和所有分析人员的结果的变异性）来确定精密度。测量不同分析日期的百分比变异系数（%CV）将有助于确定分析的变异性。例如，预计qPCR检测的精度将具有低变异性（<10%CV）。然而，分析的可变性增加表明了进一步优化方法以提高分析精度的途径。这些性能参数用于生成将通过分析验证的稳健可靠的分析。这些参数来自美国食品药品管理局（FDA）-国际人用药品技术要求协调委员会（ICH）指南和我们的经验。我们的目标是开发能够容忍微小变化并有助于在早期保持更高水平的生产力和效率的稳健分析。检测或方法的稳健性是指检测不受上述微小但有意的方法变化影响的能力，并表明其在正常使用期间的可靠性。尽早评估稳健性将最大限度地减少分析验证期间后期返工的可能性。

3.放行和产品表征分析的自动化

与自动化和数字化时代同步，需要iPSC流程和分析的自动化，因为方法自动化仍然是疗法商业化的关键，并将能够处理更多的在制品和放行样本。任何给定的分析方法，如酶联免疫测定（ELISA）、细胞计数和活力（CCV）、基于流式细胞术的测定和定量聚合酶链反应（qPCR），都具有自动化的潜力。未来放行分析必须侧重于快速获得结果，这反过来又有助于快速放行最终产品并缩短实验室到患者的时间。此外，FIO分析的自动化将有助于更快地进行产品表征。图1和3，表3

图1.常见放行和表征检测：描述了用于（A）无菌和安全性的检测，包括无菌、支原体、内毒素、重编程清除和核型检测。（B）鉴定和纯度包括流式细胞术和碱性磷酸酶检测。（C）安全使用包括端粒分析、HLA表征和先天性疾病标志物。（D）iPSC文库的内容放行检测包括细胞计数和活力测定。

我们已经为包括CCV、ELISA在内的多种检测建立了自动化程序，并且正在采取额外的检测以实现自动化。例如，在这里报告了使用Tecan Freedom Evo技术自动化基于ELISA的分析的可行性，该技术是一种机器人，可以快速、可靠和高效地进行分析。手动与自动ELISA分析之间的比较研究表明，自动化方法的精密度更高，%CV降低（图2）。显示数据分布的箱形图中表示的方差系数百分比（%CV）表明，对于自动方法，大部分测量的CV值位于低端，这证实了自动化变异性低于手动变异性。大多数标准品的吸光度读数（OD值）在两次运行之间相似，表明ELISA原始数据在自动和手动执行之间没有变化，而手动执行具有更高的可变性。此外，这项比较研究表明，自动化可以减少手动作时间（HOT）并节省执行检测所需的资源数量，因为使用自动化时，平均HOT从6.5小时（手动时间）减少到3小时（表2）。

图2.（A）与手动加载相比，自动化（Tecan）的四分位距较低，在箱形图中表示的变异系数（%CV）较低。（B）自动化运行和手动运行之间的吸光度读数相当，而手动运行中的标准偏差高于自动化运行。

图3.（A）从CD34+细胞生成iPSC细胞库并分化为心肌细胞、T细胞和NK细胞的图示。（B）生成的iPSC库的拟议放行检测包括通过流式细胞术检测的鉴定和纯度、使用NC-200和ViCell的CCV、使用ddPCR和qPCR的重编程清除、使用FPERT和QPERT的细胞主库病毒检测。（C）建议的表征分析包括常规核型分析、组织学、ALP染色、替代方法（如Pluritest和记分卡分析）、端粒分析（作为潜在测试）和专门用于iPSC制造的新型分析。

表2.分析的指标显示手动和自动ELISA在分析人员时间、分析精度和FTE方面的差异

表3.使用体外和体内测定法测试最终hiPSC库是否存在外源病毒而进行的MCB病毒测试列表

未来的测试策略将使用自动化结合其中一些技术，以更好地了解iPSC的潜力和功能特征。这最终将为临床相关的iPSC产品生成新的表征分析。这些方法可以进一步应用于表征多种治疗方式，从癌症免疫疗法到通过高通量筛选测定进行疫苗开发。

4.适合用途的放行和表征分析

适用性方法验证意味着应根据数据的预期用途和相关监管要求对分析进行验证。检测验证过程从选择正确的检测开始，然后将该检测开发为经过验证的方法。测定的适当选择或设计取决于方法的应用和相应技术的局限性。在方法验证过程中可以使用各种类型的检测方法，包括用于身份的标记物的荧光检测、用于获得初始和最终分化药品的准确细胞计数的细胞计数活力、使用PCR技术进行残留检测，以及使用QPERT/FPERT进行病毒污染的主细胞库检测（图2）。

4.1.基于流式细胞术的iPSC鉴定和纯度检测

设计合适的流式细胞术检测组合取决于（i）起始材料，（ii）通过重编程产生或在扩增过程中建立的多能干细胞，涵盖iPSC和人ESC，以及（iii）定向分化为最终细胞治疗产品。

起始材料：不同的组织作为iPSC发育的起始材料。人脐带血因其易于获取的特性而具有优势，HLA减少了限制性，并降低了同种异体反应的风险。用于识别起始组织来源细胞干性电位的常见表面分子包括：CD34（识别造血干细胞和祖细胞）、CD9（白细胞抗原）、CD133（Prominin1）、CD30（肿瘤坏死因子受体）、CD200（MRCOX-2抗原）和CD38（环状ADP核糖水解酶）。

通过重编程和扩增产生的多能干细胞：用于在分化前检测干细胞的检测组合中包含的常见多能性标志物包括OCT4、NANOG、SOX2。当iPSC分化成专门的后代时，分化过程仍可能携带残留的iPSC，需要识别和消除这些残留，以避免在临床应用前出现任何问题。已经确定了几种表面标志物来区分与hESC共享的iPSC。用于识别iPSC的最常见基因是TRA-1-60、阶段特异性胚胎抗原4（SSEA4）和TRA-1-81。SSEA-4表达似乎先于TRA-1-60和TRA-1-80的表达，它们只能在后期分化阶段检测到。TRA-1-60和TRA-1-80是糖蛋白鬼萼素的独特表位，用于鉴定和分离ESC。

靶向治疗性细胞治疗产品：据报道，iPSC靶向分化为各种最终细胞产品，包括用于治疗应用的心肌细胞、T细胞、NK细胞和B细胞。在这些情况下，最终产品的表征是必不可少的，并且需要在放行面板中包括适当的最终产品纯度测定。例如，心肌细胞产品将有一个流式面板，用于识别从iPSC分化中获得的最终心肌细胞的纯度。这将包含成熟的心肌细胞标志物，例如C-肌钙蛋白、钙电压门控通道、肌球蛋白轻链和重链以及转录因子GATA-4。同样，T细胞产物将包含淋巴细胞标志物，如CD3、CD4、CD8和CD56（阴性标志物）。此外，NK细胞产物将包含CD16（FcγRIII）CD57、CD56、NKG2C等标志物，并可能证实这些细胞对CD3呈阴性。

干细胞类型（ESC或iPSC）：我们和其他人开发了不同的染色组合来确定起始材料（来自UCB的CD34细胞）的质量、扩增第4天CD34细胞的扩增水平和纯度（之前重编程为iPSC）以及iPSC表型的表征（重编程和扩增后）。已经为各种细胞治疗产品建立了最终产品特异性流式细胞术检测组合，例如用于分泌胰岛素的β细胞的细胞质C肽、核蛋白NKX6.1、胰岛素启动因子PDX1和运动神经元和胰腺同源盒（MNX1），以及淋巴细胞CD7和CD5的簇分化标志物作为T细胞祖细胞和CD3、CD4、CD8作为成熟的最终T细胞产物。用于过程和最终药品测试的流式细胞术面板都经过严格的优化，在此过程中，测试分析的特异性、线性、准确性和精密度等参数，以得出产品规格。分析优化过程中的一个关键步骤是将可靠的参考对照设置为系统适用性，用于确认分析性能的流式细胞术分析。

4.2.细胞计数和活力（CCV）

细胞计数和活力是一个经常被忽视的考虑因素，因为它似乎是一种简单的方法，但却是确定给定细胞悬液中活细胞准确数量的关键步骤，并且是细胞系开发的一部分。最关键的CCV测量是测试最终分化细胞产品的瓶装密度。接种用于靶向iPSC分化的细胞数量也应被视为维持初始补料和分化过程一致性的关键参数。在分化开始过程中准确测量活细胞、传代、细胞扩增和收获时的细胞密度，可以更好地进行过程控制，并最终更准确地评估给予患者的分化细胞数量。

合适的CCV检测方法的设计取决于细胞类型、细胞悬液的异质性、细胞培养形式（即单细胞或聚集细胞）。一些细胞类型（如iPSC）倾向于在2D培养物中形成大菌落或成簇，需要酶、化学或机械解离方法进行连续传代培养。如此大聚集体中的单个细胞往往会叠加，从而降低了使用手动计数方法（血细胞计数器）进行细胞计数的准确性和精密度。为了提高细胞计数的准确性、精密度、速度、可重复性和便利性（内置算法功能），已经开发了几种自动细胞计数仪技术（如Nucleo Counter®NC-200、Vi-CELL细胞活力分析仪、Cellometer自动细胞计数仪）。自动化技术的成功实施取决于细胞染色、图像显示参数和细胞形态的调整，以获得与血球计数器相当的精度、准确度和线性度。对于iPSC，我们已经证明NC-100和NC-200自动细胞计数装置可用于估计用于iPSC平台开发的活细胞和细胞活力。自动化NucleoCounterNC-200（Chemometec）使用吖啶橙（细胞膜）和碘化丙啶（活力），而其他细胞计数方法，如测速仪（Nexcelom）、Vi-CELL（BeckmanCoulter）使用台盼蓝作为活力染料。所有这些自动化系统都可用于评估给定细胞类型的适当细胞计数方法。因此，总计数来自单独裂解等分试样的聚合细胞方案可用于iPSC聚集体。符合GMP标准的软件需要与仪器一起专门用于细胞计数。

4.3.重新编程清除率

清除率或残留检测需要根据重编程过程进行定制，例如质粒转染、使用病毒/病毒载体和转座子转导质粒。通过使用非整合游离型EBNA/OriP质粒过表达“Yamanaka因子”，然后分析评估这些细胞的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc以及Lin28的表达，从而实现重编程。EBNA/OriP质粒通常用于重编程，因为它是一种非整合质粒，可通过连续传代从细胞中清除。安全要求和指南表明，这些细胞必须显示所用质粒的完全清除率，这表明需要一种完全合格的检测方法，可以定量和证明质粒的完全清除率。检测残留质粒的最可靠方法之一是基于TaqMan的qPCR，它允许设计识别特定核酸序列的引物和探针，具有高度的特异性和灵敏度，仅与特异性DNA结合，而不是基于Sybr的技术结合所有双链DNA。我们之前曾报道过使用这种方法扩增和测量重编程质粒的EBNA和OriP区域。除了水和Ct差异分析外，通过在载体H9gDNA中制备EBNA质粒标准品来进一步评估特异性。然而，使用这种方法正确评估质粒清除率可能存在一些挑战。例如，EBNA和OriP区域只是大于1000kb质粒的小片段，质粒的其他片段片段可能保留在细胞内而不被检测。此外，虽然PCR方法具有很高的灵敏度，但任何分析的检测限（LOD）很少是完美的零。因此，可能需要更灵敏的方法来检测重编程后的残留质粒。

在较新的技术中可以找到更灵敏的方法，例如通过数字液滴PCR或（ddPCR）、下一代测序（NGS）进行分析。数字液滴PCR（ddPCR）采用与许多qPCR过程相同的TaqMan化学试剂，但由于ddPCR能够计数绝对拷贝数，因此比qPCR方法具有更高的灵敏度。使用ddPCR，将样品和PCR预混液上样，然后形成约20000个液滴。然后对液滴进行PCR，并在扩增过程中单独读取探针放行的荧光。通过测量存在的绝对拷贝数，ddPCR能够检测稀有种群。然而，ddPCR保持与qPCR相同的风险，即质粒组分可能仍然存在于细胞内。这种方法的风险可以通过设计多个引物探针组来降低，这样就可以检测质粒的多个区域，以确保没有剩余的质粒片段。NGS可对样品中的所有DNA或RNA进行测序，使其成为检测残留重编程质粒的宝贵工具。使用NGS技术将允许对所选工作细胞库中的整个基因组进行测序，并寻找整个pEB-C5或pEB-Tg质粒的片段，而不仅仅是EBNA/OriP片段。然而，尽管目前市场上有市售的仪器，例如IlluminiaMiSEQ和ABISOLiD平台，但全基因组测序仍然相当昂贵。

4.4.主细胞库病毒检测

将同种异体产品作为主细胞库发布并用于临床，需要对病毒污染物的存在进行广泛的测试。过去，我们证明，使用适当的检测方法并考虑到多能干细胞的细胞特性，可以调整并利用MCB病毒检测组合来放行最终的人iPSC库。多种体外和体内分析方法可用于评估最终产品中可能存在的病毒污染物，包括逆转录病毒、腺相关病毒以及牛、猪和人病毒。由于这些方法用于放行或拒绝细胞库，因此它们需要稳定、可靠、适合用途，并且经过认证或验证。MCB检测组中使用的检测方法的选择和适合目的对于充分评估病毒污染物至关重要，因为此类方法用于确定库的放行或拒绝，并可能产生严重的安全考虑。

在最终细胞库中检测逆转录病毒的常用方法之一是PCR增强型逆转录酶（PERT）检测，该检测使用逆转录酶的存在，该酶可驱动RNA转化为逆转录病毒中特异性存在的cDNA。PERT检测通过样品中存在的逆转录酶（即上清液）的活性评估样品将RNA模板转化为cDNA模板的能力。然而，已经证明样品中过量的DNA聚合酶活性会干扰并提高这些检测中的背景信号，这可能导致样品中逆转录酶活性的测量不正确。有两种常见的基于PERT的检测可用于检测细胞库中的逆转录病毒，包括QPERT和FPERT。QPERT（定量PCR增强型逆转录酶）检测是逆转录酶检测的一种定量形式。将测试样品中观察到的活性与标准曲线进行比较，以返回样品中逆转录酶活性的定量测量。这些结果通常以逆转录酶（RT）单位/mL的形式返回。该检测已设计并常规执行（在服务实验室）以评估RT活性，作为过程检测策略的一部分，以评估整个制造过程中的逆转录病毒水平。整个过程中RT活性的增加将预示着污染事件。因此，在检测的初始建立期间，假阳性的可能性并不是主要问题。此外，该检测最突出地用于利用具有内源性逆转录病毒污染的细胞类型（即禽细胞疫苗）的生物加工过程。FPERT（荧光PCR增强逆转录酶）检测是逆转录酶检测的一种定性形式。该检测采用与QPERT检测相同的机制，返回定性读数，而不是特异性活性读数。作为定性测量，该检测的结果与在检测限（LOD）下含有RT活性的标准品相关表示。该测定旨在评估批量收获和生物过程最终产物中的RT活性（以及逆转录病毒的存在）。通常，行业标准使用FPERT进行发布，使用QPERT进行进程内处理。

根据历史数据设置适当的产品特异性规格对于为最终产品分析证书（CoA）建立适当的放行测定至关重要。特别是，根据测定的定性与定量性质，必须选择适当的放行标准和规格。在我们看来，iPSC细胞中存在快速细胞分裂，因此具有高水平的DNA聚合酶活性，这要求如果要使用定量测定（即QPERT）来放行细胞制剂（即iPSC），则应在放行和产品CoA中使用基于历史数据的适当产品特异性规格。对于“未检出”规格，定性方法会更合适，例如FPERT分析。

5.最终产品表征分析

需要进行表征分析/测试，以解决干细胞制剂克隆之间和内部的可变性。这最终将有助于为选择用于分化为所需细胞谱系的高功能细胞系设定规范。这些表征分析中的每一种都可以提供有关干细胞的健康、寿命和分化潜力的不同但有价值的信息，从而增加为患者需求选择高质量细胞批次的机会。本文将总结其中一些用于进一步表征iPSC和iPSC衍生产物的方法。

5.1.常规方法（核型/组织学/碱性磷酸酶）

多能性的常规测试包括核型分析和组织学分析。核型分析是监测基因组完整性和检测iPSC异常的成熟技术之一。iPSC的治疗应用依赖于iPSC细胞的稳定性和基因组完整性。核型分析可确保染色体数量和形态在重编程和分化过程中保持完整。在细胞治疗领域，常规监测基因组完整性和识别严重改变对于产品安全至关重要。虽然并非所有基因组异常都是有害的，但有些异常可能会影响iPSC分化能力，并可能导致接受基于iPSC的治疗的患者发生肿瘤。病理生物学领域（包括干细胞的检测）依赖于活检的组织学分析以进行DNA分析。然而，从长远来看，这是不可持续的，因为iPSC需要更精细的技术来破译分子线索、信号转导和准确的群体检测。利用多种技术可提供iPSC基因组异常的完整快照。碱性磷酸酶（AP）活性在多能干细胞中上调，包括未分化的胚胎干细胞（ESC）、胚胎生殖细胞（EGC）和iPSC。碱性磷酸酶活染色剂可维持干细胞活力，因此非常适合在重编程工作流程的早期阶段筛选集落。它也可以在后期用作识别未分化细胞的阴性选择工具。我们使用ALP染色作为维持人iPSC和ESC的标准方法，以表征良好生产规范条件下的主细胞库和工作细胞库。ALP已被用作“仅供参考（FIO）”的分析方法，用于iPSC表征目的。

5.2.已建立的替代方法（PluriTest、qPCR评分卡、Teratoscore）

iPSC检测领域的最新进展解决了这种多能细胞类型固有的挑战。这些发展表明，确定人类多能性细胞系开发潜力的替代技术很少，包括TeratoScore（开源平台）和ThermoFisher的PluriTest分析和qPCRScoreCard。使用阵列（Affymetrix、Illumina）和RNA-Seq数据结果的多能性分析可进一步用于PluriTest和TeratoScore分析。TeratoScore是一个在线开源平台，用于区分多能干细胞来源的畸胎瘤和恶性肿瘤。该测定基于畸胎瘤的形成，用于测试人类多能干细胞分化成所有胚胎胚层的能力，并将细胞效力转化为定量测量。PluriTest是一种生物信息学分析，其中将测试细胞系的转录组与大量已知多能细胞系的转录组进行比较。该测试不直接评估分化能力，但可以排除与未分化干细胞有很大差异的细胞。在建立新的PSC细胞系的早期阶段，一个重要的考虑因素是快速检测少量细胞，这可以通过PluriTest来实现。我们已经建立了一种三胚层qPCR来表征细胞谱系。该检测需要是一种放行检测，因为它提供了有关基因特征的详细信息，能够产生最终发育成体内所有细胞类型的三个胚芽层。这种基因特征的基因表达谱分析和生物信息学定量产生了多能性记分卡测定。Score Card可用于基因表达特征，以量化分化效率。

5.3.可能的方法（端粒分析、TAT、Q-TRAP）

除了这些使用记分卡测试多能性的既定替代技术外，我们还建议使用端粒测量和活性作为多能性读数。端粒调节、维持和稳态对于iPSC的长期培养至关重要。端粒酶活性和端粒长度在iPSC的产生和功能中起着重要作用。在这些细胞的重编程过程中，端粒酶激活和端粒长度延长发生。端粒分析在与细胞衍生产品的质量相关的体外和体内研究中非常有用，并可以准确评估干细胞和iPSC的分化潜力。端粒分析技术（TAT）是一种端粒长度测定测定法，可测量任何细胞系的中位端粒长度。TAT利用高通量Q-FISH（定量-荧光原位杂交）技术。Q-TRAP（端粒重复扩增方案）可评估血液淋巴细胞和其他生物样品中全细胞裂解物中的端粒酶活性。这两种分析干细胞中端粒长度和端粒酶活性的技术可用作iPSC健康和功能的宝贵指标，因此，可作为iPSC重编程和分化的软传感器。这也可用于选择具有高度功能以进行进一步差异化活动的制造细胞批次。因此，我们之前使用端粒分析来区分新鲜解冻的iPSC和15代龄的iPSC。

5.4.专用于iPSC生产的新型检测

Wanget.al最近报道了一种基于微流控芯片的新型技术，用于定量稀有hPSCs。该方法基于干细胞定量细胞术，能够在低成本、可制造的微流控芯片中超灵敏地捕获、分析和计数用磁性纳米颗粒标记的痕量hPSC。微流控技术已被用于检测hPSC衍生的心肌细胞群中的稀有hPSC，并且可以扩展到检测其他hPSC衍生产品中的此类稀有细胞群。除了Lonza基于qPCR的残留iPSC检测外，Kuroda等人还建立了一种灵敏的检测方法，用于使用液滴数字PCR（ddPCR）检测心肌细胞中残留的未分化hiPSC。作者使用带有LIN28探针和引物的ddPCR方法，在原代心肌细胞中显著检测到低至0.001%的未分化hiPSC。这些新技术允许建立高度准确的分析方法，用于评估安全性和iPSC产品表征。

流式细胞术技术通常用于通过使用荧光标记抗体定量细胞表面抗原表达来识别各种细胞类型，包括干细胞。这些方法通常被认为是身份测定法，也提供有关干细胞产物纯度的信息。从两色细胞标记物检测到甚至可以检测内部标记物的多色细胞特异性基因标记物，流式方法已经有了巨大的改进。基于PCR的技术也被用于检测细胞特异性基因，这也可以考虑用于检测干细胞产物的纯度。如前所述，基于PCR的新技术（例如液滴数字PCR）正在开发中，以提高测量iPSC及其衍生物关键特性的准确性和有效性，包括纯度和安全性（即残留杂质）。

几个参数对于选择合适的放行和表征检测至关重要，包括来自干细胞的治疗产物、样品时间、靶标标志物以及检测所需的灵敏度。虽然流式细胞术更省时且更具成本效益，但PCR具有更高的灵敏度。然而，流式细胞术和PCR不能相互替代，但如果在临床试验中作为优化风险分层的互补作用使用，则具有优势。

6.结论和未来展望

iPSC的前景在于它们能够开发基于患者特异性和同种异体干细胞的疗法。基于细胞的疗法针对多种疾病开发，包括糖尿病、视网膜色素沉着、退行性疾病和帕金森氏症，Sigilon Therapeutics、Viacyte和Vertex Pharmaceutical等制药公司正在进行的临床试验显示出积极的结果。理想的iPSC工艺将在整个生产过程步骤中使用零占地面积方法（例如，使用非整合mRNA进行重编程），并采用适当的放行和表征分析，高效、可重现并符合cGMP要求。考虑到数量和质量信息之间的平衡、成本、过程侵入性、获得结果的时间和群体的样本代表性，经过分析的优化过程有望具有高质量、安全和有效的多能干细胞产品特性。

为了妥善解决基于iPSC的疗法商业化的生产挑战，我们提出了一些举措，包括专注于详细的iPSC表征、符合cGMP的iPSC的长期稳定性、使用基于计算机控制的3D生物反应器制造工艺来减少劳动力和制造足迹，在整个过程中实施适当的过程监控。此外，我们还设计并建立了适用于不同起始材料和最终产品表征的分析方法，以及与GMP级iPSC生成整个过程（过程和放行分析）相关的分析方法。此外，转向自动化分析是可行的，并且可以带来可靠和加速的结果。正如本综述所强调的那样，使用适用目的验证方法实施适当的分析方法进行过程和最终放行测试，这对于跟踪产品在生产和准备放行过程中的关键质量属性至关重要。

干细胞疗法在基于细胞的疗法、高通量药物发现和毒理学平台领域具有巨大的希望。支持大规模非免疫原性iPSC库生产的可扩展、封闭培养系统与自动化、适用、经验证的放行测定相结合，可以指导器官替代疗法。还需要GMP投诉软件和数据分析工具，用于旨在放行治疗产品的分析分析。自动化高通量药物发现、下一代测序、多能性检测和端粒分析等分析进步有助于破译参与iPSC多能状态、维持和分化的分子通路。将人工智能纳入现有的分析方法将有助于了解iPSC中的细胞行为、相关的复杂基因调控网络、分子线索和分化途径的轨迹。

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