转录组数据如同"鸡毛"般能指示风向，但真正要发"令箭"指导临床决策时，必须通过蛋白水平的验证。好的研究设计应该像拼图一样，让不同技术各司其职又相互印证。建议实验设计时：①先用单细胞/空间转录组发现候选靶点；②用mIHC在独立队列验证关键蛋白标志物；③对关键通路可结合Western blot或质谱进一步确认。

1.转录组与蛋白表达的差异。mRNA水平仅能反映基因表达的部分信息，由于存在转录后调控、翻译效率差异和蛋白降解等因素，mRNA与蛋白水平的相关系数通常仅在0.4-0.7之间。重要翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）完全无法通过转录组数据体现。

2.空间转录组的技术限制。当前主流空间转录组技术（如10x Visium）分辨率在55μm，单个spot仍包含多个细胞。新兴的亚细胞级技术（如MERFISH）虽能检测单细胞RNA，但仅限预设的数百种基因。

3.免疫组化的不可替代性。多重免疫组化（mIHC）可同时检测4-8种蛋白标记，实现细胞表型精确定位。数字病理分析（如HALO, QuPath）能定量蛋白表达的空间分布特征。重要临床标志物（如PD-L1、HER2）必须通过蛋白水平验证。