撰文丨咸姐

线粒体是细胞内的能量工厂，其基因组（ mtDNA ）编码了两种 rRNA 、 22 种 tRNA 和 11 种 mRNA ，其中两种是双顺反子。线粒体 mRNA 的翻译发生在膜相关核糖体上，这些核糖体与 OXA1L 插入酶协同作用，将翻译产物插入到线粒体内膜中。线粒体编码蛋白合成的缺陷与许多严重的人类疾病有关，例如神经退行性疾病和代谢紊乱【1,2】。然而，线粒体基因表达的调控机制仍然是一个未解之谜。毫无疑问，深入理解线粒体基因表达的调控机制对于揭示这些疾病的发病机制和开发新的治疗方法具有重要意义。尽管已经有一些初步尝试在体外重建线粒体翻译，并通过核糖体分析来评估其动态变化，但目前对协调线粒体基因表达过程的蛋白质以及指导 mRNA 进行翻译的机制仍知之甚少。此外，目前也不清楚随着时间的推移，细胞是如何应对特定线粒体编码多肽合成的挑战的。与核 DNA 不同， mtDNA 无法通过 CRISPR 进行基因编辑，因为将 RNA 运输到线粒体中并不是一种成熟的方法。相反，使用细菌胞嘧啶脱氨酶对 mtDNA 进行靶向基因编辑的方法直到最近才成为可能【3,4】。然而，目前仍然缺乏能够在细胞中以简单且动力学明确的方式选择性沉默线粒体蛋白表达的方法。靶向线粒体蛋白质合成的合适工具的缺乏无疑对线粒体基因表达的研究受到了极大的限制。

鉴于此，近 日，来自德国哥廷根大学医学中心的PeterRehling团队在Science在线发表题为Silencing mitochondrial gene expression in living cells的文章，开发了一种简单高效的方法，能够选择性地靶向并沉默细胞中的特定线粒体mRNA。该方法使用由线粒体靶向肽和聚吗啉寡核苷酸组成的嵌合体，通过点击化学合成，并导入线粒体以阻断翻译， 能够 同时靶向多种 mRNA ， 且 可应用于广泛的细胞类型 ，并实现全面监测细胞多时间的响应 ， 为理解线粒体翻译及其在细胞生理中的整合提供了见解，并为在活细胞中研究线粒体基因表达提供了一种策略。这种方法有可能被用于分析一系列细胞模型系统中线粒体基因表达的机制和病理生理学。

本文研究人员在早先的研究中 已经建立了一个系统，通过将吗啉代（ morpholino ）寡核苷酸与线粒体前体蛋白连接，将这些吗啉代导入纯化的线粒体中以沉默线粒体基因表达。然而，这种方法存在局限性，因为它需要在体外对分离的线粒体进行导入和后续的基因表达分析，且无法在细胞环境中分析线粒体基因表达的挑战，也不能用于理解线粒体与细胞核之间的交流。此外，之前设计的前体蛋白 - 吗啉代嵌合体在细胞中调节线粒体翻译的效果不佳。因此，研究人员设计了一种替代的嵌合体，将前体靶向模块替换为前序列（指位于线粒体蛋白 N 端的线粒体靶向序列，该序列在蛋白质定位完成后会被切除）肽，以在活细胞中靶向线粒体 mRNA 。经过测试各种前序列肽，研究人员选择了 Cox4 前序列，通过点击化学（ click chemistry ）嵌合体在线粒体中的作用机制示意图将其与吗啉代合成嵌合体 （ pCox4-MO ） ，并将其导入线粒体， 初步 实验结果证实这种新的嵌合体能够通过抑制核糖体 -mRNA 的相互作用有效地阻断翻译，从而抑制翻译 ，并且可以同时特异性地沉默多个 mRNA（图1）。

图1 嵌合体在线粒体中的作用机制示意图

为了在完整的哺乳动物细胞中抑制线粒体基因的表达，嵌合体必须具有高浓度、化学稳定性和易于运输到细胞内的特征。 研究人员证实，上述 pCox4-MO 嵌合体 符合这些要求，且可以有效地转染， 高效地导入线粒体，并特异性地阻断特定线粒体 mRNA 的翻译，对线粒体基因的表达具有很好的沉默效果 。此外， 研究人员在多种细胞类型中测试了这种方法，包括人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞和小鼠肝细胞，发现嵌合体能够有效地沉默目标基因的表达，并且这种沉默效果是特异性的，不影响线粒体的形态和 DNA 的丰度 ，证明将该嵌合体转染进细胞可以在不同的生物学背景下阻断线粒体 mRNA 的翻译。

随后，研究人员深入探讨了通过嵌合体介导的线粒体基因沉默对细胞转录组的影响。 利用 nanoString 技术和 RNA 测序（ RNA-seq ）来监测线粒体 mRNA 水平的变化以及核基因表达的响应，研究发现，当特定的线粒体基因被沉默时，不仅目标 mRNA 的水平会下降，而且核基因表达也会发生显著变化，这表明线粒体与细胞核之间存在复杂的通信机制。而沉默不同线粒体基因会导致不同的核基因表达模式，这表明线粒体与细胞核之间的通信具有高度的特异性。通过 UpSet 可视化方法分析，研究人员确定了在不同沉默条件下共同变化的基因集，这些基因主要涉及基因表达、细胞呼吸和线粒体功能。这些结果表明，线粒体与细胞核之间的通信表现出与靶向的线粒体 mRNA 相关的特定模式，且核基因表达的响应似乎比之前认为的更具层次性。不同氧化磷酸化（ OXPHOS ）复合体的亚基或同一复合体中不同核心组分的缺失，对细胞基因表达谱有着不同的影响。

与此同时，研究人员通过转染特定嵌合体沉默线粒体基因，研究其对线粒体功能的影响。实验发现，沉默 ND2 、 CYTB 、 COX1 和 ATP8 基因分别导致相应 OXPHOS 复合体（ I 、 III 、 IV 和 V ）活性显著下降，且这种影响具有特异性 ，而且还影响了复合体的组装和超复合体的形成 。 而基因沉默导致的 OXPHOS 复合体活性下降会引发细胞代谢向糖酵解代谢的转变。此外，沉默线粒体基因表达导致线粒体蛋白质组发生高度特异性的变化，这些变化可以在数小时至数天的时间范围内被监测到。 在这种情况下，复合体 I 、 III 或 IV 的缺失（分别通过沉默 ND2 、 CYTB 和 COX1 实现）并没有显著改变其他氧化磷酸化（ OXPHOS ）复合体或其亚基的丰度。本文研究结果还揭示了这样一个事件顺序，即 COX1 的缺失首先影响了 COX1 模块蛋白、复合体 IV 的组装因子以及 COX2 和 COX3 模块，随后通过具有双重功能的组装因子（如 COA3 、 TMEM186 等）将影响传递给其他 OXPHOS 复合体（图2）。 这些发现表明，线粒体基因的沉默对线粒体功能产生了选择性和特异性的改变，这些改变不仅局限于单一复合体，还可能通过复杂的机制影响整个线粒体呼吸链的功能。

图2 在沉默COX1后，OXPHOS缺陷的逐渐和顺序传播

为了进一步说明它们的功能意义，研究人员从蛋白质组学数据中选择了三种蛋白 ——ZNF703 、 TMEM186 和 SMIM26—— 它们在沉默 COX1 后显示出丰度改变，且定位与线粒体。实验结果表明，这些蛋白质与线粒体基因表达、 OXPHOS 复合体的组装和功能密切相关。例如， TMEM186 与复合体 I 和 IV 的组装相关， ZNF703 参与 COX2 模块的生物发生，而 SMIM26 则与新合成的线粒体编码蛋白相互作用。总之，在COX1沉默的背景下观察到的线粒体蛋白质组的改变有助于识别出与线粒体基因表达过程相关联的蛋白质，并且同时与OXPHOS复合体的组装和功能相关。

综上所述，本研究开发了一种实验策略，能够在活细胞中特异性地沉默线粒体mRNA表达。通过使用前序列 - 吗啉代嵌合体实现在 3 到 72 小时内阻断特定转录本的翻译。这种方法的应用揭示了线粒体与细胞核之间的复杂相互作用，为线粒体生物发生和基因表达的调控提供了新的见解，同时帮助识别了影响线粒体生物发生和细胞稳态的因素。这些发现挑战了关于氧化磷酸化系统中复合体I、III和IV的缺失会对其他复合体产生即时连锁效应的假设。这种基于嵌合体的线粒体 mRNA 沉默策略的可用性，为研究人员提供了一个宝贵的工具，用于研究线粒体基因表达、蛋白质生物发生及其在细胞生理中的整合。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adr3498

制版人： 十一

参考文献

1. O. Rackham, A. Filipovska , Organization and expression of the mammalian mitochondrial genome.Nat. Rev. Genet.23, 606–623 (2022).

2. R. W. Taylor, D. M. Turnbull, Mitochondrial DNA mutations in human disease.Nat. Rev. Genet.6, 389–402 (2005).

3. P. Silva-Pinheiro, M. Minczuk , The potential of mitochondrial genome engineering.Nat. Rev. Genet.23, 199–214 (2022).

4. B. Y. Mok , M. H. de Moraes , J. Zeng, et al, A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.Nature583, 631–637 (2020).

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