卵黄蛋白原（ Vitellogenin, VIT ）是载脂蛋白卵黄蛋白的前体，广泛存在于卵生动物中。 VIT 在体细胞中合成，经体液循环系统运输至生殖系统，为胚胎发育提供营养。在人类中，其同源蛋白 apoB-100 （ apolipoprotein B-100 ）是组装低密度脂蛋白（ low density lipoprotein ， LDL ）和极低密度脂蛋白 (very low density lipoprotein ， VLDL) 的骨架蛋白，负责将肝脏合成的脂类通过血液转运至全身。 ApoB-100 功能异常与动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病密切相关。因此，深入理解 VIT 的分泌机制不仅有助于揭示秀丽隐杆线虫（ Caenorhabditis elegans ）母体与子代间的资源分配策略，也能为哺乳动物脂蛋白分泌机制提供理论参考。尽管早在四十多年前就已发现，线虫的肠道合成 VIT 并将其分泌到假体腔中，但肠道分泌 VIT 的具体途径未被完全阐明。
近日，北京生命科学研究所 / 清华大学生物医学交叉研究院董梦秋团队在Life Metabolism期刊发表题为RME-1-associated recycling endosomes participate in vitellogenin secretion inCaenorhabditis elegans的研究论文。
论文发现，VIT的分泌不仅依赖经典分泌途径，还依赖循环内体（ recycling endosome ， RE ）。VIT在肠道的粗面内质网（ rough ER ）中合成，后被转运至高尔基体（ Golgi apparatus ），经高尔基体网络（ trans-Golgi network, TGN ）运出。从这里运出的满载 VIT 的膜泡一部分直接被发往肠道细胞基底侧，与那里的质膜融合后将 VIT 卸货到假体腔中，另一部分则被发往循环内体，然后再分泌到假体腔中。本研究还发现循环内体的标志性功能蛋白 RME-1 紧邻卵黄蛋白原膜泡（ VIT-containing Vesicle, VV ），此分布模式依赖于内吞循环途径中 RME-1 上游调控因子 RAB-10 。 RAB-10 还介导 VV 从肠顶端向基底侧的定向运输。本研究揭示了循环内体既参与新合成 VIT 的分泌，又参与内吞来源的卵黄蛋白的重新分泌，即将肠道细胞从假体腔中回收来的卵黄蛋白再送回假体腔（ Fi g. 1 ）。类似机制在 apoB-100 相关研究中未见报道，或可为研究哺乳动物载脂蛋白的分泌途径提供思路。
Figure 1.Graphic summary: both the conventional secretion pathway and REs are required for VIT secretion in C. elegans intestine.
研究人员对 79 个囊泡运输相关的基因进行 RNAi 筛选，发现单一地敲低其中 35 个基因会导致 VIT-2::GFP 在 线虫 肠道中积累。根据这些基因的功能，作者推测经典分泌途径与循环内体共同调节 VIT 的分泌。免疫电镜实验验证了 VIT 在肠道细胞粗面内质网中合成，其输出依赖于内质网出口位点（ ER exit site ）蛋白（包括 SFT-4 ， SEC-13 ， SEC-23 和 TNGL-1 等）的表达；随后 COPII 囊泡将 VIT 转运至高尔基体中。敲降高尔基体内部转运相关基因会导致 VIT-2::GFP 在肠道细胞中积累。 VIT 出 TGN 后被包裹在分泌囊泡中，分泌囊泡通过外泌体复合物与质膜融合完成分泌。这些结果说明经典分泌途径介导 VIT 的分泌（ Fig. 2 ）。
Figure 2. Silencing genes involved in the conventional secretion pathway led to VIT-2::GFP accumulation in the intestine.
研究者还发现敲降 rab-10 （促进早期内体成熟为循环内体）、 rme-1 （促进循环内体形成管状结构，介导内吞物转运至细胞膜）等调控肠道基底侧内吞循环相关的基因会导致 VIT-2::GFP 在肠道中积累。此外，敲降参与 TGN 到循环内体运输的相关基因（如 chc-1 、 smap-1 、 apt-9 ）同样使 VIT-2::GFP 在肠道中积累。这些结果表明循环内体也参与 VIT 的分泌（ Fig. 3 ）。
Figure 3. Disruption of recycling endosome-related genes led to VIT-2::GFP accumulation in the intestine.
为进一步验证循环内体在 VIT 分泌中的作用，研究者敲降了 rme-1 ，发现线虫肠道内出现大量膨大的循环内体，其中既有弥散的低亮度 VIT-2::GFP 信号，也有聚集成液滴状的高亮度 VIT-2::GFP 信号。免疫电镜证实，这些循环内体具有单层生物膜（磷脂双分子层），而内部的 VIT 液滴无膜包裹。膨大循环内体中的液滴状结构能够被靶向 VIT-1/2 的胶体金颗粒标记，其标记密度与 VV 内含物的标记密度无显著差异（ Fig. 4 ）。进一步实验表明，同时敲降 rme-1 和内吞相关基因（如 dyn-1 、 rab-5 、 dlc-1 等）可显著减少含有 VIT-2::GFP 的膨大循环内体的个数，说明循环内体中的 VIT 至少部分来源于假体腔中的卵黄蛋白。此外，在敲降 rme-1 的同时再敲降参与 ERES 组装的基因或参与从 TGN 到循环内体转运相关的基因，也可显著减少含有 VIT-2::GFP 的膨大循环内体的个数，说明至少有一部分新合成的 VIT 被运送到循环内体中。
研究还发现， RME-1::RFP 定位于 VIT-2::GFP 标记的卵黄蛋白原膜泡（ VV ）外围。每个 VV 至少与一个 RME-1::RFP 荧光点毗邻，反之每一个 RME-1::RFP 荧光点至少毗邻一个 VV 。鉴于 RME-1 是循环内体的标志蛋白，此结果暗示着 VV 与循环内体紧密地定位。此外，内吞循环途径中 RME-1 上游调节因子 RAB-10 缺失会使肠道内的 VV 数目显著增加，且更多的 VV 和 VIT-2::GFP 分布在肠道顶端一侧，表明 RAB-10 促进 VV 从肠道顶端向基底侧运输。值得注意的是， RAB-10 缺失会破坏 RME-1 在 VV 外围的定位，并逆转 RME-1::RFP 和 VV 在肠道的极性分布，证实 RAB-10 是 RME-1 定位及功能发挥的必要条件。
最后，本研究通过组织特异性 RNAi 实验证实，线虫肠道中 VIT-2::GFP 的积累表型由肠道细胞自主性调控。共聚焦实验显示，生殖腺特异性 RNAi 经典分泌途径或内吞循环相关基因虽会导致假体腔卵黄蛋白积累，但未引起 VIT-2::GFP 积累在肠道中的表型；而肠道特异性 RNAi 同样的基因则可重现 VIT-2::GFP 在肠道中积累的表型。该结果排除了假体腔卵黄蛋白积累对肠道 VIT 积累表型的间接影响。
总之，这项工作系统阐述了线虫肠道分泌VIT的机制，揭示了经典分泌途径和循环内体协同调控VIT的分泌，或可为探索哺乳动物脂蛋白（尤其是apoB-100）的分泌途径提供线索。
https://academic.oup.com/lifemeta/advance-article/doi/10.1093/lifemeta/loaf026/8177094
制版人：十一
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