脑声小店基于深度科研洞察，专注为动物实验提供"简器械·精实验"解决方案。我们突破高精设备局限，开发手工定制化仪器及配件，通过科研巧思将基础工具转化为创新实验方案。产品涵盖行为学装置、操作辅助工具等，使实验室在保持操作简效的同时，实现精细化数据采集，助力科研人员以创造性思维发掘简易仪器的潜在科研价值。
啮齿类动物--小鼠的本能社交行为非常依赖于嗅觉信息的引导。小鼠能够通过身体外周的各种腺体，例如泪腺、生殖腺向外界分泌包含大量化学物质的体液。这些化合物中有许多已经被发现具备调节小鼠内分泌活动并调节行为的功能。小鼠对嗅觉刺激的初始感知主要是来源于主嗅上皮（main olfactory epithelium，MOE）以及犁鼻器（vomero nasal organ，VNO）中的感觉神经元。MOE的感觉神经元主要接收飘散在空气中挥发性小分子化合物的刺激，VNO的感觉神经元则主要接收非挥发性的大分子物质的刺激。同时，VNO也是小鼠探测信息素的主要嗅觉器官。嗅觉辨别能力是嗅觉功能中最基本的能力之一。
SPF级7-8周龄雄性BALB/c小鼠，体重18-22g。小鼠运动灵活，身体匀称，毛发干净，无搔鼻动作及喷嚏，对外界反应敏感。自由饮水，环境温度18-24℃，相对湿度10%。
嗅觉障碍模型
临用前配置3-MI溶液。3-MI溶解于玉米油中制成浓度为15mg／ml的溶液，给药剂量为150mg／kg，给药方式是腹腔注射。B、C组小鼠注射3-MI溶液，A组予以注射同体积的玉米油溶液。干预方法C组小鼠于建模后第1天开始行嗅觉训练。4种嗅素即玫瑰精油、柠檬精油、丁香精油及桉叶油醇分别取200μL和5mL蒸馏水混匀后，放入雾化机内。B组小鼠使用蒸馏水雾化，取4组5mL蒸馏水放入雾化机内。将雾化机的喷雾口接入小鼠笼内，打开雾化机，每种嗅素让小鼠持续吸入30分钟，每天2次，共训练28天。期间正常饮水、摄食。A组小鼠不予任何治疗措施，正常饲养。
动物分组与模型制备实验分为2组：对照组（Control）和嗅觉剥夺组（Olfactory deprivation）。选用出生后12d的C57Thy1-YFP小鼠，予氯仿40μL滴入小鼠一侧鼻腔，破坏一侧嗅觉复制嗅觉剥夺小鼠模型，嗅觉剥夺侧脑区为嗅觉剥夺组，对侧即为对照组。嗅觉剥夺1周后进行行为学触须视频拍摄，如小鼠触须功能增强则表明模型建立成功，主要表现在触须震动的频率、幅度或给予同一刺激强度触须伸、屈的时间长短，若嗅觉剥夺后小鼠嗅觉剥夺对侧的触须震动频率、幅度或伸、屈的时间明显增加说明模型建立成功。
嗅觉损毁3天后，进行嗅觉检测，用嗅觉检测同样的条件和程序对损毁组和对照姐进行检测。如果嗅觉损毁组在10分钟内未找到食物，记为10分钟。损毁组10钟内未找到食物为损毁嗅觉成功，若遇到假阳性（小鼠在趴垫料中碰巧翻到），应重新检测。若检测嗅觉未有损毁或者损毁不彻底的，应再次损毁或者剔除。
嗅觉可恢复性损毁
使用异氟烷将小鼠进行深度麻醉，并用25ul微量进样器吸取10ul的0.9%生理盐水或者0.9%生理盐水配制好的10%的硫酸锌溶液缓缓滴入ICR小鼠的一侧鼻腔，待小鼠清醒6h后，重复操作滴入另一侧鼻腔。注：在滴鼻过程中注意小鼠处于深度麻醉过程中，以防中间清醒影响滴鼻溶液的吸入。
嗅觉剥夺对小鼠触须功能的影响
嗅觉相关行为实验评估
交配行为范式
交配行为学实验在实验动物雄性攻击行为实验测试完成后进行。实验开始之后，将一只群养的激素诱导发情的雌性小鼠放入本地小鼠的笼子当中，进行30min的实验测试。在两只小鼠的互相接触活动过程中，雄性小鼠主动地嗅闻雌性小鼠的生殖器的行为被定义为“生殖器嗅闻（genital sniff）”；雄鼠从后面爬到雌鼠的背上，前爪用力抱住雌鼠的行为被定义为“骑跨行为（mount）”；当雄鼠爬在雌鼠的背上，利用生殖器对雌鼠进行抽插的行为被定义为“生殖器插入（intromission）”；当雄鼠结束了生殖器的抽插，并抱住雌鼠僵硬地倒在一边时，定义为“射精（ejaculation）”，每只实验小鼠将进行两次，2到3次的交配行为学测试，每次测试之间的时间至少间隔两天以上，以避免射精后不应期对小鼠行为产生影响。
尿液偏好
尿液偏好实验在单笼饲养的雄性小鼠笼子当中进行，实验开始之前准备好3×3cm大小的滤纸片。对于雄性尿液偏好实验，在一张滤纸片上滴加50μl的雄性小鼠尿液，另外一张滤纸滴加50μl的生理盐水作为对照。实验开始之后，将两张滤纸片同时放入小鼠的笼子中，分别放在距离较远的两个角落，小鼠对两张滤纸片进行5min的探索；对于雌性尿液偏好实验，在一张滤纸片上滴加50μl激素诱导发情的雌鼠尿液，另外一张滤纸片上滴加50μl的生理盐水作为对照，和雄性尿液偏好实验相同，两张滤纸片同时放入小鼠笼中，进行5min的实验录像。每只实验小鼠进行1至2次的雄性尿液和雌性尿液偏好的实验。
嗅觉辨别行为
2个相同的木箱(45cm×45cm×30cm)，每个箱子内放置2个间隔10cm的瓷皿。在每个瓷皿内放置1张滴10μl的未稀释的柠檬香精、薄荷香精或蒸馏水的滤纸。嗅觉辨别任务嗅觉辨别是指从一组气味中辨别出不同和相同气味，是嗅觉系统的基本功能之一。本实验使用薄荷香精和柠檬香精气味，小鼠对这2种气味没有偏好。采用在啮齿类动物中常用的习惯化－去习惯化模型，在此实验过程中，把小鼠头朝某一个方向放入木箱内，小鼠在箱内自由活动。每个动物有6次任务，前5次任务使动物对某种气味产生习惯化。前5次任务中，木箱内的2个瓷皿内，随机滴入柠檬香精或蒸馏水，每次任务允许小鼠在木箱内停留5min，两次任务之间间隔15min。在第6次任务时，两个瓷皿内滴入新异气味(薄荷香精)或蒸馏水。观察小鼠嗅瓷皿内气味的时间，当小鼠距离瓷皿1cm内，并作出嗅的动作时开始计时。若动物在第6次任务时停留在新异气味的时间多于第5次任务时停留在习惯气味侧的时间，说明动物能分辨出2种不同的气味，反之，则不能分辨出不同气味。不同动物及不同任务之间，及时清理木箱、瓷皿，并更换滤纸。
旷场行为测试
旷场（Openfield）实验箱分为大鼠实验箱和小鼠实验箱两种。小鼠旷场实验箱的规格为底边50cm的正方形，高度为45cm的灰白色箱体。大鼠实验箱的规格为底边1m的正方形，高度为45cm的黑色箱体。在箱体正上方有一摄像头，具体高度可随情况而定但一定要使摄像头的视野覆盖整个实验箱体内部。摄像头通过数据线连接到电脑上，通过专业的行为学软件自动记录小鼠的行为。动物行为学软件为VisuTrack。将每只小鼠的头朝同一方向放入旷场行为箱中，记录5min内小鼠爬格子的次数以检测小鼠的活动量，直立(后脚站立)的次数评价小鼠对新异环境的探究行为。
脑声常谈建立了多个《动物模型构建与行为评估》交流群，群内分享各种经典和前沿的行为范式，共同交流解决动物实验中遇到的棘手问题，避坑少走弯路！有需要的老师可以扫码添加微信进入讨论群！
攻击行为范式
领地攻击行为学实验采用的是经典的“居民-入侵者”行为学范式。实验开始之后，将一只群养的BALB/c雄性入侵小鼠放入至本地小鼠的笼子当中进行15min的测试，过程录像。两只小鼠进行活动的过程当中，本地小鼠主动地利用鼻子去嗅闻入侵小鼠生殖器的时候，会被定义为“生殖器嗅闻（genital sniff）”；当本地小鼠主动地用鼻子去接触入侵小鼠生殖器以外的身体其他部位时，会被定义为“社交接触（social contact）”；“攻击行为（attack）”则是指本地小鼠对入侵小鼠进行撕咬，摔跤，站立拳击等行为，每只实验小鼠将进行2到3次的攻击行为学测试，每次测试之间时间间隔至少一天以上。
气味探索实验
气味探索实验仪器分为两部分1实验箱体：气味实验箱用无味的亚克力塑料板制作而成，箱体长为40cm，宽度和高度均为30cm，四周为黑色，下方无色透明。2给气系统：主要由给气泵、活性炭、流量计、三通管组成，这些设备之间用无味的塑料软管连接。气味使用给气泵吹入，在箱体一角底部有直径为1cm的圆孔用于实验气味的进入。使用流量计控制气体的出入量稳定在1L/min。在实验气味和给气泵之间放置活性炭用来去除其他气味。在箱体上方有50cm处放置摄像头用于记录小鼠行为，使用Anymaze软件进行记录。
气味躲避实验
实验前一天把小鼠放入实验箱体适应10min。实验当天准备好实验箱体并打开行为学软件设置好程序，打开给气泵。首先把小鼠放入箱体让其适应3min，此时给予空气。适应结束后给予矿物油气味10min，最后给予0.1%2MT气味10min。此实验过程全程用Anymaze软件进行记录。通过软件统计小鼠探索气味区域的时间以及和恐惧相关的指标。每只小鼠测试完毕用75%酒精彻底擦净箱体避免小鼠留下气味对后面实验的造成影响。
嗅觉剥夺1周后进行小鼠行为学触须视频拍摄，观察和统计分析小鼠嗅觉剥夺侧和对侧触须的摆动频率及触须屈曲的时间。整个行为学实验在安静的环境中进行，室温18~25℃，无噪声和强光刺激。
埋藏食物实验（Buried Food Test）
实验第一天喂食小熊饼干，让小鼠熟悉并知晓饼干为可吃食品；第二天，禁食24h（不禁水）；第三天，准备两个新笼子，一个为小鼠适应笼（40cm×20cm），另一个为测试笼（60cm×30cm），均铺上3cm左右的新垫料，在测试笼的其中一角垫料下方埋藏一块小熊饼干。将小鼠放在适应笼适应5min，之后放入测试笼，让其在中探索10min，并记录下其找到饼干的时间，找到饼干的时间>5min视为嗅觉损毁。当每只小鼠测试完毕后，需更换或搅拌适应笼和测试笼的垫料，以防饼干遗留气味不匀的情况。
水迷宫测试（MirrorWaterMaze，MWM）
该实验均在一个1.5m直径的水池中进行，实验总长为7天，水池中水温度保持在23℃左右。实验开始前期，由水迷宫测试软件（SMART3.0）将水池均分为四个象限（A，B，C，D;A象限对C象限，B象限对D象限），并在每个象限的池边贴上不同拓扑学结构的荧光标记物，以形成不同象限记忆点。第一天，在其中一个象限内放上水平台并注水，但此时，水池内平台恰好高于水面，以让小鼠知晓在水池内有平台的存在。小鼠从四个象限中任意一个象限进入水池，并在水池内自由探索1min，当1min探索时间结束后，若小鼠还没有找到水平台，将人为引导小鼠到水平台之上，并让其在水平台上呆15s，熟悉平台。对照组小鼠和实验组小鼠均分为四组，设立不同的水平台位置，并由不同位置入水，以排除其他影响因素。第二天，将水池中的水没过水平台3cm左右，保证小鼠可以在水平台上站稳但有看不见平台，重复第一天的实验操作。第三天到第六天，重复第二天的实验操作，并且每次在实验前，保证水池中水的清洁度。第七天检测小鼠的空间记忆结果，将水池中的平台撤出水池，小鼠将由所设平台的对面平台入水，记录小鼠找到平台的时间（Time of Latency to platform），在平台区域停留时间（Time of platform），在平台所在象限探索时间（Time of Quadrant）。在实验开始前，需要将进行实验的小鼠提前2h搬去水迷宫行为检测的房间，以适应实验环境，排除其他环境干扰。
条件恐惧箱实验（Fear Conditioning Test，FCT）
此实验为期4天，实验期间保持每天实验时间的一致性，并在每次实验前2h将小鼠放置到条件恐惧箱测试房间。条件恐惧箱主要包括视频采集系统，声音刺激系统，足部刺激板系统，以及场景设置。条件恐惧箱实验第一天为适应期（Habituation），让小鼠在条件恐惧测试箱中停留600s，使其熟悉箱中的环境（在箱中贴有条纹背景）；第二天，为训练期（Training），将小鼠放入箱中后，给予环境、声音和足部电刺激的配对刺激（声音:19s，98db，2kHz;足击:1s，0.75mA;），总时长为820s，共计5个刺激循环，刺激间隔为2min。第三天为场景条件恐惧记忆测试（Context），小鼠在条件恐惧箱中自由探索600s，环境与第二天训练期给予的环境保持一致，不给予声音刺激和足底电刺激。第四天为线索条件恐惧记忆测试（Cue），小鼠在箱中探索820s，更换箱中的环境背景，给予与训练期配对的五个循环的声音刺激（20s，19db，2kHz），每次声音刺激间隔2min，无足底电刺激。在实验过程中需每次清洁箱中环境，并用酒精擦拭，尽量去除上一只测试鼠所遗留的痕迹。在本实验中，均在MED软件以及装置下完成。
参考文献：
1、Intranasal application of glucocorticoid alleviates olfactory dysfunctionin mice with allergic rhinitis[J]. Xiaowei Wang;;Yingying Zhu;;Daofeng Ni;;Wei Lv;;Zhiqiang Gao;;Fang Qi.Experimental and Therapeutic Medicine,2017(5)
2、Effects of ZnSO 4 -induced peripheral anosmia on zebrafish behavior and physiology[J]. Murilo S. Abreu;;Ana C.V.V. Giacomini;;Rubens Rodriguez;;Allan V. Kalueff;;Leonardo J.G. Barcellos.Behavioural Brain Research,2017
3、The Effectiveness of Aromatherapy in Reducing Pain: A Systematic Review and Meta-Analysis[J]. Shaheen E. Lakhan;;Heather Sheafer;;Deborah Tepper;;Giustino Varrassi.Pain Research and Treatment,2016
4、Recovery of Olfactory Function Induces Neuroplasticity Effects in Patients with Smell Loss[J]. Kathrin Kollndorfer;;Ksenia Kowalczyk;;Elisabeth Hoche;;Christian A. Mueller;;Michael Pollak;;Siegfried Trattnig;;Veronika Sch?pf;;Ma?gorzata Kossut.Neural Plasticity,2014
5、Olfaction in Neurologic and Neurodegenerative Diseases: A Literature Review[J]. Maria Godoy;;Richard Voegels;;Fábio Pinna;;Rui Imamura;;José Farfel.Int. Arch. Otorhinolaryngol.,2014
6、Olfactory training for patients with olfactory loss after upper respiratory tract infections[J]. K. Gei?ler;;H. Reimann;;H. Gudziol;;T. Bitter;;O. Guntinas-Lichius.European Archives of Oto-Rhino-Laryngology,2014(6)
7、倪虹,丁海虎,陶静等.嗅觉剥夺对小鼠大脑桶状皮层谷氨酸能神经元动作电位及Ankyrin-G表达的影响[J].南方医科大学学报,2020,40(02):262-267.
8、Asaba A, Hattori T, Mogi K, et al. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice[J]. Frontiers in Neuroscience, 2014, 8:231.
9、Bayless DW, Yang T, Mason MM, et al. Limbic Neurons Shape Sex Recognition and Social Behavior in Sexually Naive Males[J]. Cell, 2019, 176:1190-1205 e1120.
10、Canteras NS, Simerly RB, Swanson LW. Projections of the ventral premammillary nucleus[J]. Journal of Comparative Neurology, 1992, 324:195-212.
11、Cavalcante JC, Bittencourt JC, Elias CF. Female odors stimulate CART neurons in the ventral premammillary nucleus of male rats[J]. Physiology & Behavior, 2006, 88:160-166.
12、Cavalcante JC, Bittencourt JC, Elias CF. Distribution of the neuronal inputs to the ventral premammillary nucleus of male and female rats[J]. Brain Research, 2014, 1582:77-90.
13、Anxiety- and depressive-like behaviors in olfactory deficient Cnga2 knockout mice[J]. Yanmei Chen;;Xiaofen Liu;;Xianglei Jia;;Wei Zong;;Yuanye Ma;;Fuqiang Xu;;Jianhong Wang.Behavioural Brain Research,2014
14、Hippocampal neurogenesis: a biomarker for depression or antidepressant effects? Methodological considerations and perspectives for future research[J]. Arnaud Tanti;;Catherine Belzung.Cell and Tissue Research,2013(1)
15、The Brain on Stress: Vulnerability and Plasticity of the Prefrontal Cortex over the Life Course[J]. Bruce S. McEwen;;John H. Morrison.Neuron,2013(1)
热门跟贴