目前，上游培养工艺一般采用fedbatch培养模式，且以平台化工艺为主，克隆构建筛选完成后，在小试规模进行平台工艺适配性确认，即可进行后续的放大，但是很多项目或者因为分子的复杂程度较高，或者对项目有更高预期，往往还需要再做不少的优化工作。

首先就是表达量的优化

无论筛选的克隆表达量起点如何，若能通过上游工艺优化再有所提升，肯定是最理想的。

表达量在不同项目细胞上表现差异巨大，有些细胞简单换个培养基表达就有显著的提升，如下面这个非对称的Trispecific分子项目，表达量换个培养基后从5.71g/L直接上升到8.34g/L，同时质量未发生明显改变甚至更优。

当然也有难优化的， 如下面这个融合蛋白分子项目，我们尝试了多种不同的培养基，以及不同的培养条件，最后表达量始终处于一个水平。

除了培养基，尝试改变一下工艺条件如接种密度和温度也可能有一定程度的改善，但是调整温度容易让质量发生漂移，因此需要综合评估。最后也可以尝试更换培养模式，比如N-1灌流模式，我们发现大部分项目从fedbatch模式切换成N-1模式后，工艺都会有一定的收益，或者表达量大幅提升，或者大大缩短培养短时间。

表达量基本上一轮做下来就比较明确了，如要继续优化，首先要花比较多的时间，其次不一定能达到预期的结果，所以需要综合考量是否要继续开展。

其次是细胞代谢的优化

一般在克隆筛选阶段会将代谢有异常的克隆剔除掉，这样工艺优化阶段就基本不会出现代谢异常的问题，因为通过工艺优化来解决代谢异常的难度比较大，如下面这个在克隆筛选阶段乳酸代谢异常的克隆，我们在反应器上摸索了多种不同的工艺条件，同时在转管上尝试了各种方法，包括添加各种因子，结果都非常有限，乳酸均出现持续的上升。

相对来说，筛选培养基、优化培养温度和控糖是较好的策略。如下面这个乳酸代谢有异常的细胞我们在反应器上进行了一定程度的控糖，细胞生长、活率维持及表达各方面均有了一定程度的改善，但是仍然不建议选择乳酸代谢异常的克隆推进，会对后续项目开发造成一系列的影响。

对糖基化的优化

CHO-K1宿主细胞的G0F-GN糖型均比较高，有些高达20%以上，初始糖型中G0F/G0F-GN/Man5/G1F四种糖型的比例之和可达90%以上，通过调糖后比例最高的四种糖一般为 G0F/G1F /Man5/G2F，所以G0F-GN能够比较容易调下来，但Man5的情况就就比较复杂，特别是对于一些初始Man5比较高的克隆，很多时候能下调的幅度有限，大部分只能下调3-5%比例，且工艺在不同规模之间存在差异，尽量在克隆筛选时挑选比例低的克隆去推进。很多时候筛选克隆阶段不同克隆之间的差异化比较低，挑选的top3或top6的糖型很相似，如下面这个项目不同克隆间Man5比例均较高。

甚至有挑出来的克隆Man5比例达30%以上的。

对于这样的克隆，只能用实验去验证是否能下调Man5比例，不同项目甚至同一项目不同克隆能下调的幅度都不一样，如下面这个单抗分子项目添加适量的调糖剂后Man5比例显著下降，同时G0F糖的比例几乎不受影响。

但这个非对称三抗分子项目下调难度就比较大，只能下调G0F-GN和G0F这两个糖，Man5基本维持不变。

另外对于末端具有唾液酸的抗体，调糖后可能会显著影响唾液酸比例，导致电荷异构发生大幅的偏移，需要慎重调糖。

聚体的控制

聚体的形成机制已有大量的文献报道，可参考蛋白聚体产生的原因，分析方法和调控手段这篇公众号。在筛选阶段不同pool会出现较大的差异，从聚体相对低的pool里挑选克隆，最后挑出聚体比例低的克隆概率就相对较高，在过往项目中，有遇到起始聚体高的可达到50%以上，如下面这个对称双抗分子，一半以上的蛋白形成了聚体。

我们在有些项目上发现聚体水平与终末活率有一定的关系，如这个双抗融合蛋白分子项目，发现终末活率最高的聚体水平相对最低，后续优化可以从这个角度考虑。

还可以从培养温度角度去优化聚体水平，如下面这个双抗项目我们通过培养温度优化聚体水平从克隆筛选的18.7%降低到8.4%，表达量还提升了，只是电荷异构发生了一些漂移，其它质量均无变化。

对于起始聚体比较低的如5%以下的细胞，通过培养工艺下调的幅度非常有限，另外出现过在不同培养规模之间聚体比例差异较大的情况，发现同工艺反应器上培养的聚体水平明显高于转管水平。

猜测可能与反应器的搅拌培养以及相对低渗有一定关系，这时可能需要在反应器规模开展优化工作，但可能优化的空间可能也有限，特别是在培养基确认了之后。

对于碎片的控制

随着分子结构越来越复杂，遇到高碎片比例的频率也越来越高，如下面这两个末端连scFv结构的分子项目，最高碎片比例可达75%以上。

从pool里面挑出碎片比例较低的细胞进行克隆挑选是最易且快的，因为本身pool阶段的差异化较大，可以挑出相对低的pool，如下两个细胞为同时筛选的两个pool，碎片低的只有4.5%，高的能到40%以上。

从上述低比例的pool2里挑出来的克隆碎片比例均比较低，在4.5%以下，符合

但碎片比例高的pool也有可能挑出来低比例的克隆，如这个双抗融合蛋白分子从起始22.5%碎片比例的pool 中挑出了碎片6.1%的克隆，工艺未有做任何优化，只是这样做会冒一定的风险。

除了筛选，通过工艺也可以一定程度下调碎片的比例，比如下面这个项目的终克隆起始的碎片比例达到13.6%，通过工艺优化后最后碎片比例下降至6.4%，表达量和其它质量未受到影响。

有些情况下，碎片和聚体的调控是一对矛盾体，下调了聚体碎片上升了，或者下调了碎片聚体又上升了，需要综合权衡。

电荷异构优化

电荷异构属于波动比较大的一个质量属性，不同细胞之间差异大，相同细胞不同工艺之间差距也比较大，相同的细胞不同批次同工艺之间也存在波动，甚至不同代次细胞之间也会存在差异，另外不同检测方法也存在较大差异，因此调控难度较大，除了类似药，新药一般不进行该质量进行特异性调控，除非影响到产品的活性。

我们有遇到酸峰非常高的项目，比例达90%以上，这个酸峰主要是唾液酸引起的。

也遇到碱峰非常高的项目，达到70%以上，这是一个KIH分子项目，猜测与末端的K及错误组装或产品断裂有一定关系。

通过培养工艺可以进行一定程度的酸碱峰调节，但不同项目的优化方向会不同，有遇到需要下调酸峰提高主峰的，也有要提高酸峰下调主峰的，如这个类似药项目筛选出来的克隆其酸峰显著偏低，主峰和碱峰偏高，均不符合质量标准（酸峰31%~46%，主峰51%-65%，碱峰≤6%），上游通过培养基筛选、培养温度优化等各种手段最后将该克隆的电荷异构均达到符合质量标准的要求。

下调酸峰的难度会大于上调难度，因为一般酸峰比例会随着培养时间增加而增加，所以可以通过减少培养时间或者调整培养温度两个方向来优化，或者更换培养模式如N-1perfusion模式，这样能保证不损失蛋白。另外比较需要注意的是如前所述调糖的时候因为糖基化的变化导致电荷异构发生的漂移。

唾液酸修饰

大部分抗体的唾液酸修饰比例是非常低的，一些融合蛋白或激素类糖蛋白的唾液酸水平会较高，有些糖蛋白激素类含糖量可达40%以上，且其中唾液酸含量非常高，通过上游工艺优化调整唾液酸的难度较大，且在不同规模培养下的波动幅度较大，我们在一个项目上发现唾液酸会随着培养天数的增加逐渐降低，如需下调唾液酸化水平，可以适当延长培养时间。另外不同培养基之间唾液酸修饰差异也较大。

对于需要上调整唾液酸比例来增强蛋白活性的项目，可以按照常规的N糖调节策略开展，有些情况下效果比较明显，如前所述的那个单抗项目，调糖后唾液酸比例从1.5%增加到18%，效果非常明显，但有些项目难度就比较大，如下面这个激素类产品，我们经过了多轮优化，均无法提升唾液酸化水平。

工艺放大

一系列工艺优化完后就是工艺放大了，放大是个非常复杂的过程，需要结合一定的理论科学知识与经验知识，我们统计了多个项目的放大数据，单纯从表达数据来看，不同项目表现各有差异，有表达量下浮的，也有表达量提升的，但大部分项目的表现一致，符合放大的正常波动范围，本篇就不再详述具体的放大细则了。

上游细胞培养工艺开发，既是科学，也是艺术，在科学与艺术之间找平衡，让项目快速推进一直是工艺人追求的目标，以上正是追求路上的一个小小缩影，欢迎大家一起探讨。

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