摘要：流感病毒引发的疫情和大流行对人类健康构成持续威胁，开发安全有效的疫苗是应对这一挑战的关键。本文系统梳理了甲型流感病毒的结构与生命周期，回顾了历史上重大流感大流行事件，对比了不同类型流感疫苗的特点，并重点阐述了亚单位流感疫苗的研发进展。文中详细介绍了基于核蛋白（NP）、基质蛋白 2 胞外域（M2e）和血凝素（HA）等蛋白的亚单位疫苗，分析了提高其 efficacy 的潜在策略，同时概述了当前处于临床试验阶段及已获批的流感疫苗。通过对现有研究的总结，本文旨在为理解流感亚单位疫苗的发展现状和未来方向提供全面参考，强调了开发广谱交叉保护的通用亚单位疫苗的重要性。推荐阅读：
一、流感病毒概述：分类、结构与生命周期1.1 流感病毒的分类
流感病毒属于正粘病毒科，根据国际病毒分类委员会的定义，该科包含五个属：甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒属和 Isavirus 属。其中，甲型和乙型流感病毒含有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）活性，而丙型流感病毒没有 NA，但其具有血凝素 - 酯酶融合（HEF）蛋白。在这三类病毒中，仅甲型和乙型流感病毒能引发临床疾病，乙型流感病毒通常仅导致局部暴发，而甲型流感病毒是引起人类大规模流行和大流行的主要病原体。
甲型流感病毒根据其表面糖蛋白 HA 和 NA 的抗原性进一步分为不同亚型，目前已发现 18 种 HA 亚型（H1-H18）和 11 种 NA 亚型（N1-N11），理论上可组合出 198 种亚型。不过，并非所有亚型都会感染人类，血清考古学数据显示，H1、H2 和 H3 亚型曾在人类中有效传播。值得关注的是，H5 亚型自 1997 年导致 6 名感染者死亡后，就被视为潜在的大流行病原体；2013 年出现的 H7N9 禽流感也引发了广泛关注。高致病性的 H5 和 H7 亚型在 HA 切割位点存在多个碱性氨基酸的积累，这增强了病毒在宿主中的全身传播能力，从而导致严重疾病。
1.2 甲型流感病毒的结构
甲型流感病毒的基因组由 8 个负链单链 RNA 片段组成，编码 11 种病毒蛋白，这些蛋白在病毒复制和子代病毒包装中发挥关键作用。主要的病毒蛋白包括结构蛋白 HA、NA、M1、M2 和 NP；三种 RNA 聚合酶，即聚合酶碱性蛋白 1（PB1）、PB2 和聚合酶酸性蛋白（PA）；以及三种非结构蛋白 NS1、NS2（核输出蛋白，NEP）和 PB1-F2（图 1）。
HA（血凝素）：在病毒颗粒表面形成刺突，介导病毒与宿主细胞表面受体的结合，并通过膜融合帮助病毒进入细胞。
NA（神经氨酸酶）：在病毒表面形成 knob 状结构，催化子代病毒从感染细胞释放，促进病毒传播并感染新的宿主细胞。
M1（基质蛋白）：在病毒组装过程中参与 RNP（核糖核蛋白）的包裹。
M2：一种跨膜蛋白，形成离子通道四聚体，具有 pH 诱导的质子转运活性。在感染初期，M2 调节病毒核心的 pH；在感染后期，将病毒跨膜蛋白转运到细胞表面。
NP（核蛋白）：作为核心抗原，在病毒复制和转录中起重要作用。
NS2：协助新合成的病毒 RNP 从细胞核输出到细胞质，以便进行子代病毒颗粒的组装。
图 1：甲型流感病毒结构示意图
病毒包含三种跨膜蛋白：HA、NA 和 M2 离子通道。基质蛋白 M1 在脂质双层下方形成蛋白层。病毒包膜内是核糖核蛋白（RNP），由 RNA 片段与 NP 以及 PA、PB1 和 PB2 聚合酶蛋白结合组成。
1.3 甲型流感病毒的生命周期
甲型流感病毒的生命周期涉及主要病毒蛋白参与的多个关键步骤（图 2）：
感染与进入：病毒通过 HA 介导与宿主细胞表面的唾液酸结合，经受体介导的内吞作用进入细胞。
膜融合与 RNP 释放：具有蛋白水解活性的 HA 在酸性 pH 条件下发生构象变化，使病毒膜与内体膜融合；随后，M2 质子通道使病毒核心酸化，导致 M1 外壳蛋白解离，病毒 RNP 释放到细胞质中。
核内复制与转录：NP 上的核定位信号促进 RNP 转运到细胞核，在那里进行病毒 mRNA 转录和基因组复制。NS1 蛋白结合双链 RNA 和宿主 mRNA 加工因子，抑制细胞干扰素诱导的抗病毒反应；聚合酶识别宿主 mRNA 的帽子结构，为病毒转录提供带帽的 mRNA 引物。
RNP 输出与组装：在 NEP 的协助下，复制后的 RNP 从细胞核输出，转运到细胞膜与包膜蛋白（HA、NA、M1 和 M2）组装。
释放：NA 通过去除唾液酸寡糖上的唾液酸，帮助新组装的病毒颗粒从细胞表面释放，并防止病毒颗粒自聚集。
图 2：甲型流感病毒生命周期示意图
以下五个步骤描述了感染性甲型流感病毒的生命周期：1）HA 蛋白结合含有唾液酸的靶细胞，随后发生内吞作用并与内体融合，导致病毒膜与内体膜融合。2）病毒 RNP 释放到细胞质中，然后转运到细胞核。3）病毒基因组要么复制，要么转录为病毒 mRNA，然后转运到细胞质进行病毒蛋白的翻译。4）病毒 RNP 从细胞核输出。5）成熟病毒在宿主细胞的细胞质膜上组装并出芽，获得病毒表面蛋白。
二、流感大流行历史与疫苗研发的重要性2.1 20 世纪的三次重大流感大流行
1918 年西班牙流感（A/H1N1）：这是历史上最严重的流感大流行，全球估计有 5000 万人死亡。基因序列和系统发育分析表明，编码 HA 和 NA 蛋白的基因来自一种在大流行前未在人类和猪中广泛传播的类禽流感病毒株。
1957-1958 年亚洲流感（A/H2N2）：由 HA、NA 和 PB1 三个新基因片段从类禽 H2N2 病毒引入，其余 5 个基因片段来自 1918 年衍生的 H1N1 谱系，导致超过 100 万人死亡。
1968 年香港流感（A/H3N2）：HA 和 PB1 两个新基因片段来自类禽 H3 和 PB1 物种，其余 6 个基因片段来自 1957 年的 H2N2 病毒，死亡人数约 70 万。此次大流行相对温和，可能与保留了 NA 蛋白有关。
2009 年甲型 H1N1 流感大流行：2009 年 4 月，一种新型猪源甲型 H1N1 病毒在墨西哥出现并迅速蔓延全球。截至 2009 年 9 月 13 日，世卫组织报告在 100 多个国家有超过 29.6 万确诊病例，至少 3400 人死亡。该病毒是北美禽 H3N2 病毒、H1N2 猪病毒和欧亚 H1N1 猪谱系病毒重组的结果，也是 1918 年大流行 H1N1 病毒的后代。
2013 年 H7N9 禽流感：2013 年 2-3 月，中国出现 3 例因新型禽源重组甲型 H7N9 病毒感染导致的严重下呼吸道疾病患者。截至 2014 年 6 月 27 日，世卫组织收到 450 例实验室确诊病例，其中 165 人死亡。尽管该病毒人际传播能力较弱且未发现持续人际传播，但仍需加强监测和疫苗研发等应对措施。
高致病性 H5N1 禽流感：H5N1 病毒于 1996 年首次从中国广东的病鹅中分离出来，2003 年起在亚洲、欧洲和非洲的家禽和野鸟中传播。1997 年香港首次确认 H5N1 病毒从禽传给人，导致 18 人住院，6 人死亡。2003-2014 年期间，全球报告 667 例感染病例，393 人死亡，死亡率接近 60%。H5N1 病毒持续存在跨物种传播并导致人类严重感染和高死亡率的威胁。
高致病性 H5N1 和其他新兴或再出现的流感病毒持续存在大流行潜力，凸显了开发有效疫苗和抗病毒药物的重要性。尽管 NA 抑制剂和 M2 抑制剂等抗病毒药物在一定程度上可用于控制大流行，但已出现多种耐药病毒株。因此，疫苗接种目前被认为是应对流感大流行最有效的措施之一。
三、流感疫苗的类型与特点
目前开发的流感疫苗包括灭活病毒疫苗、减毒活病毒疫苗、DNA 疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒（VLP）疫苗和亚单位疫苗。不同类型疫苗的优缺点及所用佐剂如下表所示：
表 1：不同类型流感疫苗的潜在优缺点
四、亚单位流感疫苗的研发进展
基于其快速、稳定、一致和可扩大的生产特点，重组亚单位疫苗已被证明是满足潜在流感大流行需求的有效策略。与其他疫苗类型相比，亚单位疫苗由于不含感染性病毒，安全性最高。针对具有大流行潜力的流感病毒（如 H5N1 和 H7N9）的亚单位疫苗正在研发中，其中病毒结构蛋白（如 M2e、HA 和 NP）是有吸引力的疫苗靶点，M1 和 NA 等其他蛋白也具有开发潜力。
4.1 基于保守 M2e 蛋白的亚单位疫苗
流感病毒 M2 四聚体在感染细胞的质膜中高密度表达，其胞外域 M2e（N 端 24 个残基）在甲型流感病毒中高度保守，其中 N 端表位 SLLTEVET（2-9 位残基）在所有甲型流感病毒亚型中几乎 100% 同源，因此 M2e 成为开发通用流感亚单位疫苗的理想靶点。
单个 M2e 分子的免疫原性较低，需要进行修饰以产生有效免疫反应。目前的改进策略包括：
构建含多个 M2e 分子的蛋白疫苗，如大肠杆菌表达的含不同 M2e 分子串联拷贝的疫苗，在鸡中对高致病性 A / 鸡 / 广东 / 04（H5N1）提供更好的保护。
将 M2e 与适当载体融合，如与多抗原肽（MAP）连接的 M2e 疫苗，在小鼠中诱导强烈的 M2e 特异性 IgG 抗体，保护其免受 PR8 A/H1N1、2009 年大流行 H1N1 或不同 H5N1 流感病毒的致死性攻击。
将 M2e 与免疫原性蛋白成分融合，利用蛋白载体自身的佐剂活性，避免使用强佐剂或额外佐剂。例如，四个 M2e 分子串联拷贝与流产布鲁氏菌发光酶 synthase（BLS-4M2e）融合，在 Iscomatrix 或明矾佐剂存在下，小鼠存活率分别为 100% 和 80%，即使无佐剂，仍有 60% 的小鼠存活；H5N1 M2e 共有序列的三个串联拷贝与激活相关蛋白 - 1（ASP-1）佐剂连接的重组融合蛋白（M2e3ASP-1），无需额外佐剂即可诱导显著的 M2e 特异性免疫反应和对不同 H5N1 病毒的跨分支保护性免疫。
NP 在流感病毒中高度保守，作为内部蛋白能诱导针对不同甲型流感病毒的交叉保护性免疫，是开发通用流感疫苗的理想靶点。研究发现，NP 可诱导强烈的 CD4+ T 细胞反应（针对两个保守表位 NP₂₆₅₋₂₇₄和 NP₁₇₄₋₁₈₄），还能诱导与保护相关的特异性 CD8+ T 细胞反应，已鉴定出至少 14 个人类 NP 肽作为细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）表位。
NP 加 Ribi 佐剂系统（RAS）与未加佐剂的 NP 相比，能增强体液和细胞免疫反应，表明基于 NP 的亚单位疫苗需要合适的佐剂。但 NP 诱导的免疫反应可能较弱，且无中和活性，无法诱导针对病毒感染的高效保护。
4.3 基于 HA 蛋白的亚单位疫苗
除高度保守的 M2e 和 NP 外，病毒表面的 HA 糖蛋白也是诱导针对流感病毒感染的保护性免疫反应的理想抗原。
全长 HA 蛋白：基于全长 HA 蛋白的亚单位疫苗在临床前试验和临床试验中显示出诱导保护性免疫的能力。例如，杆状病毒系统表达的针对高致病性经典 H5N1 流感病毒 HA 的重组蛋白（rH5HA），可保护小鼠免受致病性禽流感病毒的致死性攻击，血清抗体持续 6 个月以上；基于 2009 年大流行 A/California/04/2009（H1N1）株重组 HA 的植物源亚单位流感疫苗 HAC1，在健康成人的 I 期临床试验中显示出免疫原性和安全性。
HA1 区域：HA1 区域（约 320 个氨基酸）比全长 HA 蛋白更具免疫原性，能诱导强效中和抗体并保护免受流感病毒感染。其 N 端较大片段形成膜远端球状结构域，包含受体结合位点和大多数病毒中和抗体识别的决定簇。研究表明，127 和 138 位残基的糖基化掩盖 HA 抗原双突变体，可诱导强效中和抗体并对异源 H5N1 分支提供交叉保护；A/Anhui/1/2005（H5N1）的重组 HA1 蛋白与人类 IgG 的 Fc 和 foldon（Fd）三聚体基序（HA1-Fdc）融合，可诱导对 HA1 蛋白的强烈免疫反应，从而交叉中和不同的 H5N1 菌株；包含 H5N1 HA1 受体结合域（RBD）的关键中和域（CND，13-263 位残基）与 Fc 和 Fd 融合（HA-13-263-Fdc），在最佳构象下诱导最强的中和抗体反应和对异源 H5N1 菌株攻击的交叉保护。但由于序列变异，HA1 亚单位通常诱导株特异性中和抗体，针对不同组变异株诱导广泛中和抗体的能力可能较低。
HA2 亚单位：HA2 亚单位比 HA1 亚单位更保守，其诱导的免疫反应（尤其是茎区）有望引发针对不同流感病毒组的广泛交叉保护性抗体，因此具有开发通用疫苗的潜力。研究显示，基于合成 HA2 肽的亚单位流感疫苗免疫可保护小鼠免受 H1N1、H3N2 和 H5N1 流感病毒的攻击；大肠杆菌表达的 HA2 蛋白可诱导免疫反应，保护小鼠免受 A/HK/68 小鼠适应株病毒的致死性攻击。但与 HA1 亚单位相比，HA2 亚单位的免疫原性可能较低，无法诱导强烈的中和抗体。
M1 蛋白：大肠杆菌表达的 M1 蛋白与壳聚糖佐剂配制，对同源 H9N2 攻击的保护率达 100%，对异源 H1N1 和 H5N1 病毒攻击的保护率分别为 70% 和 30%，表明 M1 蛋白可能诱导针对变异病毒株的广谱免疫。
NA 蛋白：虽然 NA 诱导的免疫对同源病毒有效，但通常认为其对不同流感病毒株的交叉反应性和交叉保护能力较弱。然而， recent 研究发现，针对 NA 保守表位（222-230 位残基）的通用单克隆抗体能抑制所有甲型流感病毒亚型，并对小鼠提供针对 I 组和 II 组病毒攻击的异亚型保护；NA 抑制抗体与雪貂对致死性 H5N1 攻击的交叉保护相关，纯化的异源 NA 蛋白加 Iscomatrix 佐剂也显示出保护作用，这些研究强调了将 NA 蛋白纳入疫苗成分的重要性。
与灭活和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗诱导的免疫原性可能较弱，但可通过多种方法提高其免疫原性和 efficacy。
5.1 使用适当的佐剂
某些特定佐剂能显著增强流感亚单位疫苗诱导的免疫反应和 / 或中和作用。例如，皂苷衍生佐剂 GPI-0100 可提高黏膜流感 HA 亚单位疫苗在免疫小鼠中的免疫原性和保护 efficacy；重组霍乱毒素 B 亚单位（rCTB）与重组杆状病毒表面展示 HA（BacHA）经鼻内免疫小鼠，与未加佐剂的 BacHA 相比，显著提高血清 IgG 和黏膜 IgA 免疫反应及血清中和抗体滴度；MF59 佐剂 trivalent 亚单位疫苗在婴幼儿中诱导针对同源和异源流感病毒株的持续增强抗体反应，血凝抑制（HI）滴度显著高于无佐剂疫苗。
5.2 融合多种病毒蛋白或与其他蛋白载体连接
融合多种流感病毒蛋白或将流感病毒蛋白与其他蛋白载体连接，也是提高亚单位流感疫苗免疫原性的有效方法，这在通用流感疫苗设计中较为常见。例如，TLR-5 配体鞭毛蛋白与四个保守 M2e 串联拷贝融合的重组蛋白，可诱导强效 M2e 特异性抗体反应，保护免疫小鼠免受流感病毒致死性攻击；流感 HA1 球状头部结构域与呼吸道合胞病毒 G 蛋白核心片段（Gcf）的融合蛋白免疫小鼠，分别诱导针对 HA1 和 Gcf 的增强血清 IgG 和黏膜 IgA 反应。
5.3 选择合适的给药途径
合适的给药途径有助于增强宿主免疫反应。例如，舌下接种亚单位流感疫苗诱导的全身抗体滴度、黏膜中和 IgA 反应和流感特异性 Th17 细胞，与肌内接种相当。
5.4 结合不同的接种策略
结合不同的接种策略也可提高亚单位疫苗的 efficacy。例如，经鼻内初免 - 肌内加强策略，用含皂苷衍生 GPI-0100 佐剂的亚单位流感疫苗免疫小鼠，可获得最佳的全身抗体和 T 细胞反应；NP 的 DNA 初免 - 蛋白加强是提高针对甲型流感病毒感染的交叉保护性免疫的实用方法。
六、处于临床试验阶段和已获批的流感疫苗
目前，多种预防甲型流感病毒感染的疫苗正在进行临床试验，部分已获批用于人类（表 2）。
表 2：部分处于临床试验阶段的流感疫苗及其阶段
6.1 临床试验阶段的疫苗
多种减毒活疫苗和灭活流感疫苗在健康成人、孕妇和儿童中进行了测试，显示出诱导特异性抗体反应的免疫原性，不同人群的抗体持续时间不同。例如，AS03B 佐剂灭活 H5N1 疫苗在 6 个月至 17 岁儿童中具有免疫原性，抗体反应可持续长达一年；而 MF59 佐剂灭活 H7N9（A/Shanghai/2/13）流感疫苗在 19-64 岁成人中诱导 59% 的血清转换率，但由于缺乏长期抗体反应或临床结果，其潜在应用可能受限。
除减毒活疫苗和灭活疫苗外，病毒载体流感疫苗在临床试验中也显示出对健康成人的免疫原性。例如，表达不同亚型 HA 和一种亚型 NP 的复制缺陷型腺病毒载体，在 18-28 岁青年中诱导高强度的体液和细胞免疫反应，并对 H5、H7 和 H9 流感病毒提供交叉保护；编码甲型/California/7/2009（H1N1）病毒 HA2 与三聚化小鼠 CD40L 融合蛋白的重组腺病毒经鼻内给药，增强特异性黏膜 IgA 和血清 IgG 抗体，诱导 HA2 特异性、CD40L 依赖的 T 细胞反应，并完全保护免受不同甲型流感病毒（包括 H1N1、H3N2 和 H9N2）的致死性攻击，显示出开发 HA2 基通用流感疫苗的可能性。
此外，越来越多处于临床试验阶段的蛋白基亚单位疫苗显示出良好的安全性、耐受性和 efficacy。例如，含 A/California/04/2009（H1N1）株 HA 的植物源重组蛋白 HAC1，能有效诱导免疫健康成人产生针对病毒感染的中和抗体反应；来自 A/Indonesia/05/2005（H5N1）的重组 HA 蛋白 HAI-05，在 18-49 岁健康成人中被证明是安全的，并诱导特异性抗 H5N1 免疫反应。
6.2 已获批的疫苗
许多处于临床试验阶段的流感疫苗已授权给制药公司进一步开发，其中大多数是灭活疫苗和减毒活疫苗。例如，Aflunov 是一种 MF59 佐剂、鸡蛋来源的 H5N1 流感疫苗，在婴儿、儿童、青少年、成人和老年人中被证明是安全且耐受性良好的，对同源（A/Vietnam/1194/2004）和异源（A/Indonesia/05/2005 或 A/Turkey/15/2006）病毒株具有强烈的免疫原性，已授权给诺华疫苗和诊断公司。
在所有获批的流感疫苗中，Flublok 是美国 FDA 批准的第一种重组疫苗，授权给 Protein Sciences Corporation（PSC）。这种昆虫细胞表达的 HA 蛋白基疫苗可扩大生产规模，为快速开发针对大流行流感的亚单位疫苗提供了坚实基础。
七、结论与展望
高致病性禽流感 H5N1、新出现的禽流感 H7N9 以及其他烈性甲型流感病毒带来的持续大流行威胁，凸显了开发安全有效的亚单位疫苗的迫切需求。与其他疫苗类型相比，基于流感病毒蛋白的亚单位疫苗具有最高的安全性。
未来，有望基于 M2e、NP 和 HA2 茎区的高度保守序列开发具有广泛交叉保护作用的通用亚单位流感疫苗，越来越多的亚单位疫苗将进入临床试验并获批用于人类。预计在亚单位疫苗设计和 efficacy 改进方面的新策略，将有助于减少未来流感大流行的威胁。
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