利用 CRISPR/Cas9 构建基因敲除单克隆细胞株，看似是一个标准化流程：gRNA 设计、载体构建、转染、筛选鉴定。但：

当初 gRNA 特异性评分几乎满分，满怀期待构质粒做转染，WB 验证全军覆没。

换脱靶评分低一点的 gRNA 序列做构建，细胞状态异常，功能数据对不上。

作为基因编辑「明星工具」，CRISPR/Cas9 系统具有高效、精准、操作简便等优势，但科研人在实操中往往深陷在gRNA 设计难、脱靶、载体/递送系统适配性等多重困局中。如何设计高效特异且脱靶率低的 gRNA？如何根据实验需求选择合适的递送系统？如何准确排除假阳性和假阴性，确保编辑效率？从体外到体内，如何利用基因编辑技术进行疾病建模和在体治疗？

丁香园联合汉恒生物将于 2025 年 8 月 26 日举办线上专题讲座「CRISPR/Cas9 基因编辑技术应用与疑难解析」。围绕CRISPR/Cas9 技术原理、流程要点、研究应用和常见问题，结合具体案例，分享实战经验并针对疑难杂症提供解决方案，助您攻克技术难关！直播间抽奖可赢取科研背包、晴雨伞、冰箱贴套装（可书写备忘，实验室必备），点击下方二维码报名～

精彩内容抢先看：

1

gRNA 的设计要点

1. 核心步骤是确定靶向目标基因的 20 nt 向导序列（位于 PAM 序列上游）。对于最常用的 spCas9 蛋白，其识别的 PAM 序列特征为 NGG（N 代表任意碱基）。

2. 高效 gRNA 设计需遵循核心原则：靶向基因所有主要转录本共有的保守外显子序列；优选位于编码区上游（5'端）的外显子以诱导无义/移码突变；避开 GC 富集区减少干扰；确保以 G 碱基开头利于 U6 启动子高效转录；并利用专业工具评估、优先选择脱靶风险最低的序列。

2

单克隆细胞株的鉴定

1. 待单克隆细胞扩增后，可提取其基因组 DNA 或总蛋白进行鉴定。常用方法包括 PCR 测序和 Western Blot（WB）鉴定。

2. WB 鉴定注意事项：移码突变可能残留 N 端肽段导致提前终止，但若产生的截短蛋白（N 端部分肽段） 仍包含抗体识别表位，则可能被检测到，造成假阳性。

内容策划：王丹琦

内容审核：朱晓芳

题图来源：图虫创意