Nat Chem Biol丨开发化学交联“二聚纳米抗体”新技术|二聚纳米抗体|化学交联|溶菌酶|膜蛋白

在结构生物学的世界里，看清一个蛋白质的精细结构就像是解开生命奥秘的钥匙。然而，对于众多分子量小于100 kDa的“小蛋白”，传统的冷冻电镜（cryo-EM）技术却常常束手无策——信号太弱，难以捕捉清晰图像。

近日，来自牛津大学的Robert J. C. Gilbert、Benjamin G. Davis、Frank von Delft、David B. Sauer和Mingda Ye团队（共同一作为Gangshun Yi、Dimitrios Mamalis和Mingda Ye）在Nature Chemical Biology上发表了文章Covalently constrained ‘Di-Gembodies’ enable parallel structure solutions by cryo-EM，开发了一种名为“Di-Gembody”（二聚纳米抗体）的辅助工具，成功应用于多种“小型”可溶蛋白和膜蛋白的结构解析，甚至首次通过此技术解析了仅有14 kDa的溶菌酶冷冻电镜结构。

背景：小蛋白，大难题

冷冻电镜虽已成为结构生物学的主流技术，但超过96%的已解析结构都大于100 kDa。自然界中绝大多数蛋白质（如人体内74.5%的蛋白质）都小于50 kDa，它们的功能至关重要，却因尺寸过小、信噪比太低，难以被清晰观测，成为领域内长期存在的技术瓶颈。

创新：巧妙的“ 二硫键交联” 策略

研究团队另辟蹊径，不再依赖传统的“融合标签”或大型支架蛋白。他们从纳米抗体（Nanobody）入手，通过精巧的工程设计，在其框架上引入了四个关键突变（S7N, L12C, Q14K, T125M），创造出了名为“Gembody”（双体）的模块。

最关键的一步是，在温和的铜离子催化条件下，两个Gembody通过第12位半胱氨酸（C12）快速、高效地形成侧链-侧链二硫键，共价连接成一个二聚“双体” （二聚纳米抗体）（Di-Gembody）。这个过程如同为两个纳米抗体找到了一个通用的“分子接口”，让它们能手拉手形成一个 “ 稳定 ” 的二聚体支架。

成果：性能卓越，应用广泛

大幅提升分辨率：研究团队用此技术成功解析了包括49 kDa的RECQL5解旋酶、59 kDa的膜蛋白SPNS2、43 kDa的MBP，乃至小至14 kDa的溶菌酶在内的多个目标结构，分辨率最高达2.45 Å （MBP）。

实现“一石二鸟”：更令人惊喜的是，团队进一步发展了异源二聚Di-Gembody技术，成功在一次实验中同时解析了两个完全不同的蛋白质（如RECQL5和绿色荧光蛋白sfGFP）的高分辨率结构，极大地提高了研究通量和工具骨架的多样性。