要理解大脑功能，关键在于揭示细胞信号如何决定正常及病理性的大脑功能。在这方面，化学遗传学技术为在自由活动的动物中以细胞类型特异性方式操控神经元及非神经元信号转导提供了极具价值的平台。DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）是一类经工程改造的G 蛋白偶联受体（GPCR），通过定向分子进化技术改造人源毒蕈碱受体，使其仅被氯氮平- N -氧化物（CNO，一种药理惰性的氯氮平代谢物） 激活且对内生配体（如乙酰胆碱）无反应。传统 GPCR 药物因受体多组织表达、配体特异性不足等问题，难以精准调控特定细胞群的信号通路，而 DREADD 可实现细胞类型特异性的 GPCR 信号调控。
关键特性：
体外和体内实验中均表现出低组成性活性（即使高表达也不易自发激活），确保调控的精准性。
案例解析：
研究背景与目的：
睡眠觉醒调节的复杂性：动物需根据内外部环境调整睡眠觉醒状态，急性应激时增强觉醒以应对挑战，但过度觉醒会导致认知能力下降，与失眠、创伤后应激障碍等疾病相关。已知多种促觉醒神经环路，但约束觉醒以防止过度觉醒的环路机制尚未明确。
不同脑区的 GABA 能神经元在睡眠-觉醒调节中功能多样，部分存在活动状态与功能结果不匹配的现象（如腹侧被盖区 GABA 能神经元觉醒时活跃但损伤后觉醒增加）。背缝核（DRN）含多种神经递质神经元，其中 GABA 能神经元是第二大群体投射广泛，但其亚型（如 DRNGAD2）在急性应激中对觉醒的调控作用尚不明确。
使用GAD2-Cre 小鼠，通过病毒注射实现对 DRNGAD2 神经元的特异性操作（以化学遗传学为例）。验证 DRN 中 GAD2 阳性 GABA 能神经元（DRNGAD2）对觉醒的直接调控作用，通过注射含 hM3Dq 的病毒使 DRNGAD2 神经元表达受 CNO 调控的兴奋性受体，CNO 注射后激活神经元。将编码兴奋性 DREADDs 的Cre依赖型腺相关病毒注射到 GAD2-Cre 小鼠的 DRN 中，该病毒仅在 DRN 中表达，在邻近脑区几乎无异位表达。通过化学遗传学手段特异性激活该神经元观察睡眠-觉醒状态及行为的变化。
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充分性验证：
Fig1 化学遗传学激活DRN中的GAD2神经元会减少觉醒（清醒）时间
首先，作者研究了 DRNGAD2 神经元是否直接参与觉醒调节，化学遗传学方法激活DRNGAD2 神经元，同时通过脑电图和肌电图记录监测睡眠-觉醒状态。
荧光原位杂交验证hM3Dq-mCherry 在 GAD2-Cre 小鼠 DRN 中表达的特异性和有效性。
在暗期开始时，以随机顺序腹腔注射 hM3Dq 的特异性配体CNO或生理盐水作为对照。与生理盐水注射相比，CNO 诱导的 DRNGAD2 神经元激活在注射后最初 3 小时显著减少了觉醒，同时 NREM 睡眠相应增加。此外，作者发现光期对 DRNGAD2 神经元的化学遗传学激活也会减少觉醒并增加 NREM 睡眠。然而，CNO 本身对DRN中表达 AAV-EF1α-DIO-mCherry 的 GAD2-Cre 小鼠的睡眠-觉醒状态无明显影响。
必要性验证（化学遗传学抑制+损毁）：
Fig2 抑制或损毁DRN中的GAD2神经元会增加觉醒（清醒）时间
接下来，作者评估了DRNGAD2神经元在觉醒/睡眠调节中的必要性。将编码抑制性DREADD的Cre依赖型腺相关病毒（AAV-EF1α-DIO-hM4Di-mCherry）注射到GAD2-Cre小鼠的DRN中。通过荧光原位杂交验证hM4Di-mCherry表达的细胞类型特异性。
在光期开始时（ZT 0），腹腔注射生理盐水或CNO（2 mg/kg或5 mg/kg）。与生理盐水对照组相比，CNO诱导的DRNGAD2神经元抑制导致光期最初3小时内觉醒时间显著增加，同时NREM睡眠相应减少，但对REM睡眠无明显影响。此外，在暗期开始时（ZT12）注射CNO与注射生理盐水相比，也增加了觉醒时间，并相应减少了NREM和REM睡眠。
作者还检测了化学遗传学抑制DRNGAD2神经元对运动活动的影响。结果发现，化学遗传学抑制DRNGAD2神经元显著增加了小鼠在旷场实验中的移动距离。这些结果表明，DRNGAD2神经元对觉醒/睡眠调节至关重要。
为进一步证实DRNGAD2神经元在觉醒/睡眠中的关键作用，作者还注射了编码白喉毒素A亚基（DTA，AAV-EF1α-DIO-DTA）的病毒以选择性损毁DRNGAD2神经元。DTA注射有效诱导了DRNGAD2神经元的缺失，表现为DRN中GAD2阳性神经元数量显著减少。在DTA注射至少4周后进行脑电图/肌电图记录。
与对照组小鼠相比，损毁DRNGAD2神经元导致觉醒时间增加，尤其在小鼠的暗期更为明显。损毁DRNGAD2神经元减少了暗期的NREM睡眠。在暗期未观察到REM睡眠的明显变化，仅在光期有轻微但显著的增加。对觉醒/睡眠结构的分析显示，损毁DRNGAD2神经元增加了暗期长时觉醒（>1分钟）的概率和持续时间。同时，损毁DRNGAD2神经元增加了觉醒状态下theta波（6–10 Hz）的功率而降低了delta波（0.5–4 Hz）的功率，表明觉醒状态更加稳定。此外，损毁DRNGAD2神经元增加了小鼠在旷场中的移动距离，表现出类似过度觉醒的行为。
结合活动依赖标记和化学遗传学技术验证应激激活的 DRNGAD2 神经元功能：
先通过活动依赖标记系统精准标记急性应激（束缚）中被激活的DRNGAD2神经元；再利用化学遗传学特异性调控这些被标记神经元观察对睡眠-觉醒的影响。
目的：验证应激激活的 DRNGAD2神经元是否直接参与约束急性应激后过度觉醒的功能。
Fig3 研究中用于验证应激激活的DRNGAD2神经元功能的关键实验环节
病毒工具与基因调控：
用两种病毒载体（rAAV - c - Fos - ITA、rAAV - TRE - Loxp - ymerOn - pdBM1 ），依赖c - Fos 启动子（仅激活的神经元会表达c-Fos）和Dox（多西环素）诱导系统，实现仅标记急性应激时被激活的 DRNGAD2神经元。
原理：当小鼠摄入 Dox（On Dox 阶段），病毒进入DRNGAD2 神经元；撤去Dox（Off Dox阶段）后，若神经元因急性束缚应激被激活（表c-Fos）则启动 ymerOn - pdBM1 表达。
实验流程：
病毒注射（On Dox）：给 GAD2-Cre小鼠DRN 注射病毒，让系统在 DRNGAD2神经元中待命。
活动依赖标记（Off Dox）：撤掉Dox，对小鼠进行急性束缚应激使被应激激活的 DRNGAD2神经元表达化学遗传学受体（ymerOn -pdBM1相关），完成标记。
化学遗传学调控（On Dox）：重新给 Dox，用生理盐水（对照）或CNO（化学遗传学配体，激活受体）处理，结合 EEG/EMG 记录睡眠-觉醒，验证标记神经元的功能。
DRN区可见大量红色+绿色共标细胞，说明急性应激激活的 DRNGAD2神经元被成功标记并表达化学遗传学受体。
数据显示，大部分被标记的 DRNGAD2 神经元都在急性应激中被激活（c-Fos+），说明标记系统精准后续调控的就是应激激活的 DRNGAD2神经元。急性应激激活的 DRNGAD2神经元可被精准标记和调控；
激活这些应激激活的DRNGAD2神经元，能显著缩短 NREM 睡眠潜伏期、减少觉醒时间、增加 NREM 睡眠，说明DRNGAD2神经元在急性应激中通过被激活来发挥约束过度觉醒、促进睡眠恢复的功能，是应激下防觉醒过度的关键神经环路节点。
文献引用：
1. Ren, S., Zhang, C., Yue, F. et al. A midbrain GABAergic circuit constrains wakefulness in a mouse model of stress. Nat Commun 15, 2722 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-46707-9
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