撰文 |咸姐

胃肠道上皮是完成食物消化、营养吸收及屏障防御的关键组织，其稳态维持依赖于隐窝底部干细胞的持续更新。与具有绒毛结构的小肠不同，结肠上皮由多个隐窝向平坦表面提供新生细胞，且其不同区段（盲肠、近端、中段、远端结肠及直肠）在上皮结构、细胞更新速率和微生物组成等方面存在差异，反映出功能特化与区域异质性。这种区域化特征进一步导致结直肠癌（CRC）易感性和病因的差异，使CRC成为一种高度异质性的疾病【1,2】。

由于经常暴露于机械损伤和高增殖压力下，结肠上皮累积致癌突变的风险显著升高。CRC已是全球第三大常见、第二大致死的癌症，发病率在许多发达国家持续上升。为了研究和应对这种疾病的进展，开发生理相关的结肠癌小鼠模型至关重要。成体干细胞是癌变的重要起源，LGR5作为贯穿胃肠道的干细胞标志物，其驱动Wnt信号通路的异常激活，可以在小鼠小肠中高效诱导癌症形成，这表明LGR5+干细胞是小肠癌的重要起源【3】。然而，由于小肠肿瘤负荷导致的快速死亡，使得无法评估结肠LGR5+干细胞在癌变中的作用，也阻碍了晚期结肠癌模型的建立。多年来，人们已经开发了针对大肠的其他CRC模型，但尚没有一种Cre驱动因子专门靶向干细胞区域，这限制了对起源于并由干细胞群体推动的癌症的研究。因此，鉴定区域特异性结肠干细胞标志物，并建立可精准靶向这些细胞的模型，是揭示CRC发生机制、构建临床相关晚期肿瘤模型的关键前提，也将为开发更有效的诊断和治疗策略提供坚实基础。

近日，来自新加坡A*STAR的Nick Barker团队在Nature Cell Biology上在线发表题为NOX1 and NPY1R mark regional colon stem cell populations that serve as cancer origins in vivo的文章，鉴定出NOX1和NPY1R作为结肠区域特异性干细胞表面标志物，分别富集于盲肠及中远端直肠的LGR5+干细胞中。利用CreERT2小鼠模型特异性扰动NOX1+或NPY1R+干细胞中Wnt信号通路，可驱动相应区域（盲肠或直肠）的结肠癌的发生，进一步联合激活致癌性Kras并敲除TRP53，可诱发晚期侵袭性癌症，由此确立了这两种CreERT2驱动程序在研究干细胞参与结肠癌发生中的重要价值。

本文研究人员首先通过荧光激活细胞分选（FACS）结合转录组学比较分析，发现Nox1是结肠LGR5⁺干细胞中最显著上调的基因之一；然后通过区域特异性RNA测序，发现在远端结肠LGR5⁺干细胞中，NPY1R是表达最显著的富集基因之一。最后通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对小肠和结肠的上皮细胞进行分析，研究人员明确了NOX1和NPY1R在干细胞群体中具有截然不同的表达模式，NOX1广泛表达于整个结肠（包括盲肠、近端、中段和远端）的LGR5⁺干细胞群，尤其在盲肠和中远端结肠的干细胞中表达最为丰富；而NPY1R的表达则严格局限于中段和远端结肠的LGR5⁺干细胞群中，在远端区域的富集程度最高，且几乎不存在于盲肠和近端结肠。利用RNAscope技术，研究人员证实了上述分析的结果，Nox1广泛存在于全结肠（尤其是盲肠和远端）的隐窝基底部，与Lgr5⁺区域高度重叠；而Npy1r则严格局限于中、远端结肠的隐窝基底部，在该区域与Lgr5共定位，且几乎不表达于近端结肠及其他胃肠道区段。

随后，研究人员构建了Nox1-2A-eGFP和Npy1r-eGFP-IRES-CreERT2两种基因敲入报告小鼠模型，其GFP表达完美再现了内源性基因的结肠表达模式，并能够准确可靠地标记并富集具有干细胞特性的结肠细胞群体。利用FACS从两种小鼠的结肠中分别分离出NOX1+和NPY1R+细胞，体外评估这些细胞形成类器官的能力。结果显示，NOX1+细胞（来自盲肠和远端结肠）以及NPY1R+细胞（来自远端结肠）均能高效形成可长期传代（超过十次）的类器官并表达多种成熟结肠细胞类型的标志物，提示其具有多向分化潜能，而对应的GFP-细胞则几乎无法形成可维持的类器官，证明NOX1⁺和NPY1R⁺细胞在体外具有强大的干细胞特性，能够形成长期自我更新的结肠类器官，并且具有分化为多种结肠细胞类型的能力。与此同时，通过Nox1-2A-CreERT2和Npy1r-eGFP-IRES-CreERT2小鼠模型，利用他莫昔芬诱导，研究人员分别对NOX1+和NPY1R+细胞进行了体内谱系追踪。与体外实验结果一致，研究证实NOX1⁺和NPY1R⁺细胞在体内也均具有长期自我更新及多向分化能力。

通过APC功能缺失突变过度激活Wnt信号是人类CRC中一个非常普遍的早期事件，因此，本文研究人员利用Nox1-2A-CreERT2小鼠模型，通过他莫昔芬诱导，特异性地在NOX1+干细胞中引入Apc基因的失活突变，模拟人类CRC中常见的Wnt信号通路异常激活。研究发现，这种基因突变主要在盲肠引发癌症，少量出现在中远端结肠，表现为大量的腺瘤形成和β-catenin的核积累，且这些肿瘤细胞表现出高增殖活性。降低他莫昔芬剂量则可进一步地实现盲肠特异性肿瘤起始，而不影响远端结肠，并在联合Kras激活和p53缺失后成功驱动具有侵袭性的晚期盲肠腺癌，从而证明在盲肠和远端结肠中存在的NOX1+干细胞是体内突变后癌症的重要来源，且其驱动模型具有区域针对性和遗传可操作性。

同样的，利用Npy1r-eGFP-IRES-CreERT2小鼠模型，通过他莫昔芬诱导，特异性地在NPY1R+干细胞中引入Apc基因的失活突变以及Kras基因的激活突变，模拟人类CRC中常见的基因突变。研究发现，这些基因突变主要在远端结肠引发癌症，表现为β-catenin的核积累和pMAPK的高表达，且这些肿瘤细胞表现出高增殖活性。即使增加他莫昔芬剂量，也能够在远端结肠中高效诱导肿瘤形成，而不影响其他区域。同时，在联合p53缺失后可成功驱动具有侵袭性特征的晚期直肠腺癌。这些结果充分证明直肠中的NPY1R+干细胞在体内Wnt信号通路失调的情况下会成为癌症形成的重要来源，由此建立了能够精准模拟人类远端结直肠癌病理进程的体内模型。

综上所述，本研究鉴定出NOX1和NPY1R作为结肠区域特异性上皮干细胞群中富集的标志物，证明NOX1+和NPY1R+细胞是结肠内的固有干细胞，在体内和体外都具有自我更新和多潜能性的特性，并利用其特异性CreERT2工具鼠驱动致癌突变，成功构建了模拟人盲肠癌和直肠癌发生的精准小鼠模型，证明了这些区域特异性干细胞是相应结肠癌的细胞起源。这项工作不仅深化了对结肠干细胞区域异质性的认知，拓宽了目前用于研究该细胞群体的有限干细胞标志物工具箱，更为解决结肠癌研究中长期缺乏区域特异性模型的瓶颈问题提供了关键工具和理论基础，对推动结直肠癌的精准建模和机制研究具有深远意义。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01763-1

制版人： 十一

参考文献

1. Tan, D. W. & Barker, N. Intestinal stem cells and their defining niche.Curr. Top. Dev. Biol.107, 77–107 (2014).

2. Imperial, R. et al. Comparative proteogenomic analysis of right-sided colon cancer, left-sided colon cancer and rectal cancer reveals distinct mutational profiles.Mol. Cancer17, 177 (2018).

3. Barker, N. et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.Nature449, 1003–1007 (2007).

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