Genome Biol丨STHD：解析亚细胞精度高维空间转录组的机器学习算法|互作|亚细胞|免疫|转录组

近年来蓬勃发展的空间转录组技术成为了疾病研究新的显微镜，它们能够将组织切片转化为基因地图的测量。随着技术的发展带来高清的基因地图，此类数据中高稀疏 + 高维度 + 高通量的新特性给细胞和基因的解读带来了极大挑战。新的算法 STHD 不再把基因地图“马赛克化”，而是使用机器学习处理微米级别像素背后的上万个基因，一次性呈现几百万个高清像素的细胞类型地图，由此可在全转录组层面更清晰地描绘细胞类型边界与组织微环境结构，为肿瘤等复杂疾病样本的机制研究与标志物发现提供高分辨率研究工具。

近年来蓬勃发展的空间转录组技术给疾病研究带来了新的手段，它们能够在组织原有的结构之上测量多个基因在细胞里的位置和表达量，使组织研究精细到细胞和分子层面。以往的空间转录组技术通常需要平衡测量精度和基因数量。一般来说，一类以成像为原理的技术可以达到高清的亚细胞精度，但是只包含几百到一千左右的基因，适合单细胞层面的细胞类型分类和特定分子的高清验证；另一类以测序为原理的技术可以包含全基因组，但是每个测序单元混合多种细胞，适合组织层面和细胞群体的基因网络研究。目前空间转录组学正迅速迈入 “ 亚细胞分辨率 + 高通量转录组覆盖 ” 的阶段，代表性技术包括 Stereo-seq，VisiumHD等等。然而，此类数据中高稀疏 + 高维度 + 高通量的新特性给空间细胞注释等多个分析步骤带来了挑战。例如，目前的 “ 先聚合邻近网格、再去卷积 ” 的工作流程面临着分辨率损失和算法扩展性的瓶颈，而病理图像驱动的细胞分割方法在复杂组织内无法处理致密细胞结构而且容易损失细胞核外信息。

最近，杜克大学张翼实验室在Genome Biology发表机器学习计算方法STHD: probabilistic cell typing of single Spots in whole Transcriptome spatial data with High Definition提出新的解决方案。不同于以往的网格聚合方法， STHD 整合单细胞转录组作为参考数据集，在亚细胞尺度上直接进行细胞类型的概率式预测，适用于 VisiumHD 和 Stereo-seq 等微米级别分辨率技术产生的高稀疏 + 高维度数据。以 VisiumHD 为例， STHD 可以在 2um 的亚细胞分辨率上输出每个空间点的细胞标签，有效防止了在其他方法中的细胞分割困难或细胞类型混杂与空间分辨率下降的问题。STHD结合梯度推导计算与patchlevel并行策略达成了高效计算，可以使用CPU在几小时内完成对整个VisiumHD样本内千万spot的推断；同时提供交互式STHDviewer，实现亚细胞尺度的组织可视化与后续空间差异分析。 STHD软件已在 https://github.com/yi-zhang/STHD 开源，适用于多种组织类型。

微米级别空间转录数据的传统分析方法主要依赖于 “ 网格聚合 + 去卷积 ” 的流程，即先将单个稀疏 spot 聚合成覆盖更多转录本的 bin （网格），再对该 bin 中混合细胞类型进行分解。这种方法虽然解决了数据稀疏性，但导致了细胞类型混杂与空间分辨率下降的问题。另外一类基于图像的细胞分割方法在复杂组织内也面临细胞分割的精度问题，且不能处理复杂细胞形态。 S THD 采用了逆向设计：直接在原始 2×2 µm 分辨率的单个 spot 层面进行细胞类型推断，在初期跳过 binning 网格聚合和细胞分割步骤，直接在高分辨率的原始基因计数上面进行计算，避免混合效应。其算法核心设计了一个双重目标函数：其一，基于泊松分布的似然函数对 spot 上每个基因的计数进行建模，参数整合了单细胞参考数据中每个细胞类型的标准表达模型；其二，邻域正则化项通过交叉熵衡量空间上相邻 spot 的细胞类型概率分布相似性，这一平滑机制由 β 参数控制。这种设计兼顾统计建模精度，也增强空间连贯性。 STHD 的输出结果既包含每个 spot 的细胞类型，也给出后验概率，便于识别边界与模糊区。在后续分析中，这些细胞标签可以支持 “cell type - stratified binning” ，即在 binning 时只聚合同类细胞，从而在提升深度的同时避免细胞类型混淆，最终增强差异表达基因与细胞互作分析的准确性。

图一 STHD 机器学习算法

现有的代表性去卷积工具，如 RCTD ， CARD ， Cell2Location 等，可以在 Visium 等低精度空间转录数据中有效推测细胞类型比例，但在此类高精度稀疏数据下容易因信号不足而失准。作者设计了高精度的空间转录组模拟数据进行测试，发现 STHD 显著提高了空间一致性，分类准确性和计算效率，精确度达到 93.97% ， AUC 分数达到 99% 。在真实 VisiumHD 数据中， S THD 的细胞标签能够精确对应到病理图像的组织结构和区域，并且每种细胞类型的标志基因呈现特异性表达，与单细胞参考数据的高度一致，体现了细胞类型预测的精准度。而且，亚细胞分辨率使得 STHD 能够发现肿瘤组织里相对稀有的细胞如免疫细胞，并且能够划分出细胞类型转变的关键边界位置。

在对结肠癌 VisiumHD 数据的分析中，作者首先利用公开的人结直肠癌单细胞参考数据集（ 37 万个细胞， 9 8  个细胞亚型）构建参考表达谱，输出了近九百万个 2um spot 的细胞类型。这些微米层面的细胞类型标签在宏观上可以区分出组织里的肿瘤上皮细胞、隐窝、间质、不同类型肿瘤纤维细胞、 stemness 干性肿瘤细胞区域、集结的免疫细胞等结构。在微观层面上， STHD 可以识别组织中的微型血管、单个免疫细胞、 SPP1+ 缺氧巨噬细胞簇、 T 细胞与髓系细胞互作活跃区、特定细胞因子通讯热点区域（如 CCL17/CCL19 ‑ CCR7 ）等肿瘤微环境中的关键结构和互作机制，为解析肿瘤免疫微环境提供了极高的分辨率。这些自动预测的细胞标签还可以有效地帮助差异表达基因的分析。以往空间转录组的差异基因分析受组织异质性大，往往区域之间的细胞丰度的变化和细胞表达的变化都会影响差异基因分析结果。利用STHD细胞类型标签分析单一类型细胞空间差异表达时，能够发现边缘的肿瘤细胞上调TNF-alpha通路，肿瘤内部的巨噬细胞上调SPP1 基因簇和hypoxia 缺氧通路。在不同的免疫细胞互作活跃区，研究者发现 T 细胞与不同的细胞类型（如巨噬细胞和树突状细胞）发生互作，而且这些区域呈现出差异性地表达不同程度的肿瘤杀伤相关基因。基于后验概率，研究者识别出细胞类型的交界前线（ frontline ），并将距离交界约一个单细胞大小的区域定义为 near-frontline ；随后在控制相同细胞对的条件下，将其与 far-frontline 进行比较。整合前线区域的转录本信息后，结果显示，在 T- 巨噬细胞对和 T- 树突状细胞对中， near-frontline 区域均表现出更高的细胞通讯活性。具体而言， T- 巨噬细胞通讯主要由 CD74-IFNG 交互驱动，而 T- 树突状细胞通讯则由 CCL17/CCL19-CCR7 交互介导，提示成熟树突状细胞在 T 细胞免疫调控中发挥重要作用。

图三结肠癌 VisiumHD 全样本的亚细胞精度注释和两个 T- 髓系细胞免疫互作活跃区

STHD 适用于多种样本与组织类型的细胞类型预测。在多个结直肠癌 VisiumHD 样本中，作者观察到这些样本呈现出一致的肿瘤、基质和免疫细胞类型，并在其中一个样本中发现特有的肿瘤三级淋巴结构，其内部包含生发中心 B 细胞和滤泡辅助性 CD4T 细胞，并表达相应的细胞因子 CXCL13 。 STHD 也适用于其他组织类型的 VisiumHD 和 Stereo-seq 数据的微米级注释；结合相应组织的单细胞数据集， STHD 展示了标注的小鼠小肠和脑组织，以及人类胰腺组织的细胞类型与结构。 STHD 软件已在 https://github.com/yi-zhang/STHD 开源。

原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-025-03608-4

杜克大学张翼课题组致力于机器学习和生物医学数据的算法开发研究，以及肿瘤和免疫相关疾病的基因组大数据应用。课题组长期招收博士后，博士生，助理研究员，科研实习生；欢迎对 AI+Bio 感兴趣的计算生物学或交叉学科背景的同学联系申请。

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