Cell | 王思远团队发明全基因组覆盖空间转录组成像新方法|rna|互作|探针|王思远|细胞|转录组

空间转录组学（spatial transcriptomics）的发展为研究复杂生物体系提供了强大的方法学框架，并已在多种组织类型及生理与病理背景中得到广泛应用，极大推动了对细胞类型、功能状态、细胞间相互作用以及组织微环境空间结构的系统性认识。尽管如此，空间转录组学尚存在显著技术瓶颈：空间分辨率 ( spatial resolution) 与基因组覆盖度 ( genomic coverage) 之间的取舍依然难以避免。

为了应对这一挑战，2025年10月1日，耶鲁大学王思远教授课题组在Cell期刊发表了题为Sequencing-free whole-genome spatial transcriptomics atsingle-moleculeresolution的研究论文，开发了名为Reverse-padlockAmpliconEncodingFluorescenceInSituHybridization (RAEFISH)的空间转录组学新方法，在该领域首次兼顾了单分子级别空间分辨率与近乎全基因组水平的覆盖度，突破了现有技术在分辨率与覆盖度之间的二选一的限制。此外，由于RAEFISH支持短RNA成像，本文还首次实现了在CRISPR筛选中原位成像检测大量不同的gRNA分子，而不需要以往技术中的条码RNA。这使得基于成像的CRISPR筛选能够更高效准确地读取基因扰动信息。

以往技术的限制

现有的空间转录组学方法包括：（1）空间捕获/标记类技术 ( spatial-capture/tagging technologies) ，其核心原理是在二维空间中用带有空间坐标的序列标记转录本，并通过非原位高通量测序解析坐标序列和转录本；（ 2 ）基于成像的空间转录组技术，通过多重荧光原位杂交（multiplexed fluorescence in situ hybridization, multiplexed FISH ）或原位测序（ in situ sequencing, ISS ）直接检测转录本在细胞、组织中的空间分布。空间捕获/标记类方法能够实现全基因组水平的转录组覆盖，但其空间分辨率相对有限，难以准确分析精细空间转录信息。相比之下，基于成像的方法可以在单分子水平实现空间定位，并保持细胞与亚细胞形态结构的完整性，支持精细分析。但目前该类技术依赖于预选有限数量的基因（几百至几千）作为检测目标，因此极大限制了对生物学问题的探索。由于预选基因通常已知与被研究的生物过程相关，基于成像的空间转录组学研究有时只产生验证性结论，而没有全新发现。因此，如何突破这两类方法的核心局限，实现既具备高分辨率又具备全基因组覆盖度的空间转录组解析，已成为推动该领域进一步发展的关键挑战。

RAEFISH的技术设计

RAEFISH利用基于成像的高分辨空间转录组学技术作为基础，突破了这类技术在基因组覆盖度方面的限制。首先，RAEFISH应用滚环扩增（rolling circle amplification ， RCA）实现对短RNA的检测，突破了传统多重荧光原位杂交（如MERFISH）无法检测短RNA的限制。然而，以往技术中滚环扩增所需的探针合成成本过高。这是以往应用滚环扩增的技术（如STARmap、10x Xenium）无法实现全基因组覆盖的原因之一。为解决这一问题，在 RAEFISH 技术中，研究人员针对每一种RNA设计了一套反向锁式探针（ reverse padlock probe）与引物探针（ priming probe ）。这一新设计在保证探针高特异性的前提下使得探针合成成本降低了超过100倍，进而使得全基因组覆盖成为可能。在编码和成像方面，研究人员采用多重荧光原位杂交 “94 选 4”（94-choose-4）的编码策略，使得每个 RNA 在94次成像中出现4次。在此编码框架下，每轮成像仅显示约 4%（4/94）的转录组信号。这一设计显著降低了信号的重叠（相较原位测序每轮成像显示约25%的被测转录本），进一步使全基因组水平的转录组解码成为可能。

RAEFISH在人类细胞系中的应用

研究人员首先在人肺腺癌细胞系 A549 中对该方法进行了验证。他们设计并合成了包含共 23,312 个人类基因的探针库，其中涵盖 16,501 个蛋白编码基因（protein-coding genes）和 6,811 个长链非编码 RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）。在 A549 细胞中，RAEFISH 成功实现了对细胞分裂周期的检测，并鉴定出一千多个细胞周期相关基因。此外，RAEFISH 还实现了亚细胞水平的 RNA 定位分析，结果显示 lncRNA 在整体上比蛋白编码 RNA有更多的细胞核定位。经典lncRNA（例如MALAT1，H19）的定位特征与它们在细胞核或细胞质中的功能相符。

RAEFISH在多种小鼠组织中的应用

为进一步评估 RAEFISH 在复杂组织环境中的适用性，研究人员设计了针对小鼠基因组的探针库，覆盖 21,955 个基因，包括 16,618 个蛋白编码基因和 5,337 个 lncRNA 。该方法在小鼠肝脏、胎盘和淋巴结三种组织中均得到验证。在此基础上，研究人员对三种组织分别开展了 RNA 空间表达和细胞互作分析。

以小鼠肝脏为例，RAEFISH 成功鉴定出了肝脏中的细胞类群，其空间分布与经典的肝脏分区（liver zonation）一致。研究人员进一步分析了肝脏中不同细胞群体的基因表达特征及其与肝脏分区的空间关联，由此鉴定出各细胞类型中的区域标志基因（zonation marker genes）。在更精细的空间尺度上，他们还解析了不同细胞类型之间的相互作用及与互作相关的基因表达差异。例如，分析显示胆管细胞（cholangiocytes）与白细胞（leukocytes）有显著互作，且与白细胞相邻的胆管细胞具有更高水平的 MHC - Ⅱ 类分子表达。相应的与胆管细胞相邻的白细胞则高表达细胞外基质蛋白，可能用于帮助这一细胞互作现象。这些结果指向胆管细胞具备抗原呈递细胞的免疫功能。

Perturb-RAEFISH的开发

研究人员进一步开发了 Perturb-RAEFISH 方法，在基于成像的高通量 CRISPR 筛选（image-based CRISPR screen）中直接原位读取细胞内的向导 RNA（guide RNA, gRNA）。在 A549 细胞中，他们开展了靶向 574 个 DNA/染色质结合蛋白编码基因的 CRISPR 敲除筛选，并结合 RAEFISH 的原位 gRNA 读取与 RNA MERFISH 转录组分析。通过该策略，他们鉴定出多个与特定生物学过程、功能相关的基因簇。以往基于成像的CRISPR 筛选技术通常需要将gRNA与更容易检测的条码RNA（barcode RNA）配对，通过成像条码RNA来确定gRNA身份。由于这类筛选常用的慢病毒（lentivirus）存在RNA重组现象，这一传统策略会导致部分gRNA与条码RNA出现错配，限制筛选的敏感度和准确性。Perturb-RAEFISH 使得这类实验不再依赖条码RNA，实现了对细胞扰动直接、高效、准确的分析。

本研究发明的RAEFISH方法突破了空间转录组领域的关键技术瓶颈，可在细胞及组织原位实现全基因组级别覆盖且单分子分辨率的空间转录组解析。该技术不仅适用于内源转录组中不同长短的RNA，也适用于人造短RNA，例如在基于成像的 CRISPR 筛选中直接读取 gRNA。RAEFISH 为生物医学研究提供了一种具有广泛适用性的工具，有望在健康与疾病研究中带来更深层次的空间性、机制性见解。