四倍体硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum）作为普通小麦的祖先之一，不仅是制作优质通心粉的重要原料作物，更是一个蕴藏着丰富抗病、抗逆和优质基因的宝贵遗传资源。由专性寄生真菌 Blumeria graminis f.sp. tritici引起的白粉病严重威胁着小麦的生产，造成显著的产量损失。培育和种植抗病品种是防治白粉病最为经济、有效且环境友好的策略，其关键在于发掘和利用多样化的抗病基因资源。源自希腊硬粒小麦品系TRI1796的 Pm68 基因位于2BS染色体末端，对白粉病具有广谱抗性，在硬粒小麦和普通小麦的抗病育种中都具有重要利用价值。
近日，江苏大学何华纲团队联合多家单位在Nature Communications杂志上发表题为An NLR pair in thePm68locus confers powdery mildew resistance in durum and common wheat的研究性论文，系统介绍了 Pm68 基因的图位克隆，证实Pm68抗性是由两个NLR基因联合控制，并揭示了两个NLR蛋白的分子互作及触发细胞死亡的机理，同时还创制了携带Pm68的抗白粉病小麦新种质，为其育种利用奠定了基础（现已分享给数十家育种单位）。
Pm68的精细定位
课题组前期报道了希腊硬粒小麦TRI1796 2BS染色体上的抗白粉病新基因Pm68，本研究利用侧翼标记Xdw03和Xdw15对来自硬粒小麦TRI1796（抗病）和PI584832（感病）F2群体的1382个单株进行筛选，获得了41个重组体。再利用一套分子标记对重组体进行基因分型，将Pm68定位在标记Xdw05/Xdw06和Xdw09/Xdw10之间0.21 cM的遗传区间内（图1a）。
调查了120份硬粒小麦，发现6份材料（包括TRI1796）表现出类似Pm68介导的过敏反应（IT0;），而其他114份材料均高感白粉病（IT4）。随后利用分子标记对抗病和感病材料进行基因分型，将Pm68位点的范围关联到Xdw08和Xdw09之间（图1b），分别对应硬粒小麦Svevo和野生二粒小麦Zavitan参考基因组的266 kb和297 kb物理区间。
在候选区域，Svevo包含了15个注释基因，而Zavitan包含了7个注释基因（图1c）。我们使用PacBio测序技术对 Pm68 的供体硬粒小麦材料TRI1796进行了基因组测序，分析显示TRI1796的 Pm68 区间与硬粒小麦Svevo参考基因组存在很大差异，而与野生二粒小麦Zavitan参考基因组高度相似，且TRI1796的7个基因都与Zavitan的注释基因一一对应，初步证实Pm68所在区段来源于野生二粒小麦。
RNA-Seq分析表明，Pm68区间只有4个叶片表达基因，其中TRIDC2BG003970和TRIDC2BG003990均编码NLR受体蛋白，TRIDC2BG004000编码U4/U6小核核糖核蛋白Prp31，TRIDC2BG003960编码一个没有结构域的未知蛋白。鉴于NLR通常负责抗病性，我们将对应于Zavitan参考基因组TRIDC2BG003970和TRIDC2BG003990的TRI1796基因锁定为Pm68的候选基因，分别称为 Pm68-1 和 Pm68-2（图1d）。
图1Pm68的图位克隆与功能验证
Pm68候选基因的功能验证
对两个候选NLR基因的序列比较表明，抗病的TRI1796和感病的Zavitan拥有完全相同的 Pm68-1编码序列（2742 bp），它们的 Pm68-2存在一个核苷酸差异（G1111T），导致Zavitan的 Pm68-2等位基因产生了一个提前终止密码子（图1d）。由于Zavitan感白粉病，推测功能正常的Pm68-2蛋白对于Pm68介导的抗性是必需的。两个候选NLR基因均不含内含子，并以头对头的方式排列，在TRI 1796基因组中相距202 kb。我们扩增了 Pm68-1和 Pm68-2 的全长编码区，构建了重组载体pLGY02-ZmUbi::Pm68-1和pLGY02-ZmUbi::Pm68-2，利用农杆菌介导法分别转化到感病小麦品种Fielder中。T0代和T1代转基因株系在苗期和成株期均对BgtYZ01表现为感病。通过杂交和自交，获得了同时携带 Pm68-1和 Pm68-2的转基因家系，在苗期和成株期均对BgtYZ01表现出抗性（图1e）。该结果表明，Pm68介导的抗性是由Pm68-1和Pm68-2联合控制。
Pm68的生化功能分析
Pm68-1编码一个典型的NLR蛋白，其包含一个N端CC结构域、一个中央NBS结构域和一个C端LRR结构域，而Pm68-2编码的则是一个非典型CC结构域的NLR蛋白。AlphaFold3预测结果显示，Pm68-2具有一个类似于典型CC结构域的四螺旋束结构，将其命名为CC样（CCl）结构域。接着在烟草叶片中进行了一系列农杆菌介导的瞬时过表达实验。我们观察到，单独表达Pm68-1或Pm68-2均不能诱导细胞死亡，而共表达两种全长蛋白则能够引发细胞死亡。在两个NLR中引入自激活突变位点，发现Pm68-1D505V激发了显著的细胞死亡，Pm68-2D545V仍不能引起细胞死亡。在NBS结构域的p-loop中引入功能失活突变位点后，Pm68-1K210R/D505V丧失了诱导细胞死亡的能力，而单独表达Pm68-1K210R或共表达Pm68-1K210R和Pm68-2均未触发细胞死亡。相比之下，共表达Pm68-1和Pm68-2K255R仍可观察到的细胞死亡（图2）。
图2 Pm68及不同结构域、突变体的烟草细胞死亡分析
免疫共沉淀实验表明，Pm68-1能与Pm68-2及其三个结构域发生相互作用（图3）。由此可见，Pm68-1是启动细胞死亡的关键因子，其活性受Pm68-2调控。为确定Pm68-2中负责调控Pm68-1细胞死亡诱导活性的区段，我们在本氏烟草叶片中分别将Pm68-1与Pm68-2的不同结构域进行共表达，结果显示，只有Pm68-1与Pm68-2_CC1的组合能够诱导细胞死亡（图2）。这表明Pm68-2的CCl结构域是调控Pm68-1活性所必需的。
图3 Pm68-1、Pm68-2及不同结构域之间互作
Pm68在小麦抗白粉病育种中具有应用潜力
为促进Pm68的育种利用，我们通过种间杂交、回交和自交将硬粒小麦TRI1796的Pm68导入小麦骨干亲本扬麦158（YM158），获得了BC3F5代渗入系，在苗期和成株期均表现出对白粉菌菌株BgtYZ01的抗性（图4a）。与轮回亲本YM158相比，渗入系的株高、单株穗数、穗粒数和千粒重均显著增加，而穗长和每穗小穗数无明显差异（图4b-4d）。对转基因小麦的调查显示，过表达Pm68-1/Pm68-2不会导致叶片出现明显的自发坏死，所测试的主要农艺性状也与受体亲本Fielder无显著差异。这些结果表明，Pm68对主要农艺性状无明显的负面影响，它在小麦和硬粒小麦抗白粉病育种中具有极大的价值。
图4Pm68渐渗系的白粉病抗性及主要农艺性状
Nature Communication杂志还分别在线报道了中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇研究员团队克隆的 PmWR183 基因和中国农业大学解超杰教授团队克隆的 MlIW39 基因，两者都是 Pm68 的功能性等位基因。
江苏大学何华纲副教授为论文的第一作者兼通讯作者，河南大学高安礼副教授和中国科学院分子植物科学卓越创新中心王亚军研究员为共同通讯作者。湘湖实验室李洪杰研究员、沙特阿卜杜拉国王科技大学Simon G. Krattinger教授等参与了该研究。这项研究得到国家自然科学基金等项目资助。
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-64048-z
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