化学键的形成和断裂是化学中的两个基本过程，这些键的性质决定了分子的物理和化学特性。在单分子水平上实时观察化学键合，可以揭示通过整体测量通常无法访问的瞬态中间体。蛋白质纳米孔具有独特的几何结构，可以被定制成纳米反应器。通过监测离子电流变化，可以可视化蛋白质纳米孔内壁反应位点上的分子键形成和断裂。因此，基于纳米孔的技术可以增强对复杂结合动力学和反应机制的理解。
成果简介
南京大学应佚伦团队在Nature Chemistry发表了题为“Understanding single-molecule reactions using nanopore-based techniques”的综述，总结了使用生物纳米孔作为单分子纳米反应器和单分子生物传感器的最新进展，讨论涵盖了纳米孔限制下的单分子反应动力学、设计生物纳米孔的策略以及在单分子水平上揭示反应中间体和途径的最新进展。最后，强调了未解决的挑战，并展望了这个快速发展的领域的未来发展。
应佚伦，南京大学化学化工学院教授、化学与生物医药创新研究院双聘PI、国家优青(2020)，国家青年拔尖人才(2019)。主要从事光电纳米孔道单分子分析与超微电流放大核心模块研制，以第一或通讯作者在Nature Nanotechnology, Nature Chemistry等期刊上发表SCI论文90余篇。
图文导读
图1 用于研究单分子反应的生物纳米孔设计
图1显示了用于研究单分子反应的生物纳米孔设计。作者通过生物工程在纳米孔特定位点引入反应基团，如半胱氨酸（Cys）或非天然氨基酸（如硒代半胱氨酸），以定制纳米反应器（图1a）。单个反应物分子在电泳力（EPF）或电渗流（EOF）驱动下被捕获到纳米孔内，与反应位点相互作用形成共价键，这一过程通过监测离子电流变化来可视化（图1b）。典型的离子电流迹线显示开放孔状态（I1）、反应物捕获（I2）、键形成（I3）和解离（I4）等阶段，其中结合时间（τon）和解离时间（τoff）用于计算反应动力学常数（图1c）。值得注意的是，基于纳米孔的系统能够区分可逆和不可逆反应事件，并提供高达亚毫秒级的时间分辨率，从而实现对单分子反应路径的实时跟踪。作者认为这种设计为揭示复杂反应网络和中间体动力学提供了强大工具。
图2 纳米孔限制设计以促进单分子反应的多种策略
图2展示了设计纳米孔限制以促进单分子反应的多种策略。作者通过化学修饰（如氧氮丙啶链接器）在α-HL纳米孔中引入反应基团，实现位点特异性功能化（图2a），或通过固相肽合成和连接将非天然氨基酸（如炔丙基甘氨酸）嵌入纳米孔结构（图2b）。此外，利用Cys营养缺陷型系统将硒代半胱氨酸引入α-HL，用于研究谷胱甘肽还原过氧化氢的中间体（图2c）。为增强反应物捕获，在AeL纳米孔中引入带正电残基（如N226Q/S228K突变）以提升电渗流速度，从而有效捕获电荷各异的分析物（图2d）。在ClyA-AS纳米孔中，其宽 lumen（直径约5 nm）可容纳单个二氢叶酸还原酶（DHFR），通过电流增强揭示配体结合过程中的三种构象体（E1、E2、E3）（图2e）。通过将AeL的K238位点突变为Cys，破坏离子对并形成静电屏障，使带电荷分子的停留时间延长约七倍，从而显著提高二硫键形成效率（图2f-g）。这些设计表明，纳米孔限制可调控反应物取向和碰撞概率，实现高达108倍的反应速率提升，为单分子催化与传感提供了优化平台。
图3 设计纳米孔进行单分子共价反应的实时观测
图3记录了利用设计纳米孔进行单分子共价反应的实时观测。作者在α-HL-Au(I)纳米反应器中监测4-戊炔酸催化转化为烯醇内酯的过程，电流迹线显示从水平1（浅绿）到水平4（深蓝）的过渡，其中水平2和3对应反应中间体，从而绘制出完整的五态催化循环路径（图3a）。在Cys突变α-HL纳米孔中，与4-磺基苯胂酸（SPAA）的取代反应产生七个 distinct 电流水平，分别对应不同对映体产物（如PSAs(OH)A的A和B水平），通过分析电流转换率揭示了硫-砷取代中砷中心的立体化学反转，并区分了“允许”与“禁止”反应路径（图3b）。此外，在K238C AeL纳米孔中，通过实时离子电流记录逐步引入N-(4-乙酰苯基)马来酰亚胺反应物，成功生成具有非相邻反应位点的1,3,5-3R-AeL异质纳米孔，产率达68%，其结构经冷冻电镜验证（分辨率2.58 Å），并展现出不对称亲水-疏水梯度，用于肽异构体的高空间分辨识别（图3c）。这些结果凸显了纳米孔在解析复杂反应网络和立体选择性中的独特优势。
图4 利用外部电场和邻近氨基酸调控纳米孔内反应平衡的策略
图4展示了利用外部电场和邻近氨基酸调控纳米孔内反应平衡的策略。作者在α-HL纳米孔中构建Cys残基轨迹，在电泳力驱动下通过连续硫醇-二硫键互换反应，指导硫醇化单链DNA（ssDNA）从cis侧向trans侧定向移动，电流残值用于定位“跳跃器”位置，并可通过电压反转实现双向运输，模拟酶促生物聚合物测序中的定向运动（图4a）。在炔烃修饰纳米孔中，Cu(I)催化叠氮-炔环加成（CuAAC）反应通过电流迹线监测，其中电压调节Cu(I)捕获：正电压增强Cu(I)结合，促进π配合物形成，而低电压稳定阳离子铜中间体，延长其寿命至毫秒级，从而揭示反应机制（图4b）。
比较K238C和G234C AeL纳米孔，前者Cys位于负电E258附近，促进亲核攻击和二硫键分裂，反应速率比中性环境G234C AeL快约37.5倍；提高pH（8.5至9.5）可加速硫醇-二硫交换，而设计E111Qα-HL纳米孔通过引入负电荷 near 反应位点，将交换速率提升5.5倍（图4c）。这些结果表明，纳米孔的局域化学环境和外场可精确调控反应平衡与动力学，为单分子合成与分析提供了可控平台。
图5 用于单分子合成的设计型纳米孔概念图
图5展示了一个用于单分子合成的设计型纳米孔概念图。反应物分子被驱动进入生物纳米孔，在反应位点进行单分子合成。通过在位点附近构建能量壁垒来引导反应物分子并延长其停留时间，以促进单分子合成与传感。反应位点催化两个反应物分子之间反应形成产物，离子电流轨迹从开放孔电流变为产物对应的电流，随后产物从纳米孔释放。电流轨迹记录了包含多个中间体电流水平的反应过程。这种可设计的纳米孔界面允许精确排列反应位点，并控制反应基团之间的取向和距离，从而决定单分子合成的反应路径。这种方法有望将纳米孔蛋白重构于巨型单层囊泡上，在优化条件下于隔室中封装反应物，实现大规模生产，产物通过纳米孔纳米反应器生成，并通过浓度或熵驱动的转运从GUV外膜释放。
文献信息
Ying, YL., Yang, CN., Liu, W. et al. Understanding single-molecule reactions using nanopore-based techniques. Nat. Chem. (2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01905-w
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