DNA水凝胶作为一种新兴的功能性纳米材料，在临床诊断与治疗中展现出巨大潜力。根据其组成，DNA水凝胶可分为两类：以DNA分子作为结构框架的“DNA框架水凝胶”以及与其他框架聚合物交联的复合型水凝胶。其中，DNA框架水凝胶在生物相容性和免疫原性方面具有独特优势。然而，该领域的研究长期以来受限于功能调控策略的缺乏以及高昂的制备成本，阻碍了其进一步的发展与应用。
为了克服这些限制，川北医学院检验医学院罗光成副教授、郭晓兰教授和四川省肿瘤医院王东生主任技师合作设计了一种自模板引物，开发出一种新型等温扩增方法。该方法仅需一种引物，无需额外模板，在低至50 nM的浓度下即可在65°C下立即触发超快核酸串联重复复制，反应在约30分钟内完成。研究表明，这一高效的等温扩增策略适用于大规模生产DNA纳米材料，并可将其集成至DNA自组装模块中，制备出强度可调、多功能的DNA框架水凝胶，应用于诸如骨组织再生等治疗场景。相关论文以“Convenient DNA Hydrogel Synthesis via Self-Templated Primer-Driven Isothermal Amplification”为题，发表在
Advanced Materials上，论文第一作者为He Hongfei。
图1 自模板引物驱动的等温扩增用于DNA框架水凝胶的制备。自模板引物本身或其引入DNA自组装模块均可快速触发该等温扩增过程，从而制备DNA框架水凝胶。所得DNA水凝胶具有良好的生物安全性，可负载药物并促进骨组织再生。
自模板引物驱动的等温扩增原理通过短串联重复序列（如AT12和GC12）实现。这些引物因其特殊序列设计可自我杂交，并在Bst DNA聚合酶作用下相互延伸，形成长链DNA产物。研究人员提出了“呼吸扩增”和“滑动扩增”两种机制，解释了在动态DNA呼吸波动作用下，如何快速生成大量串联重复序列。凝胶电泳结果显示，AT12在37°C和65°C下均能有效启动扩增，且在高温下反应更快、产物分子量更大、分布更均匀。进一步实验表明，引物长度与Bst聚合酶的结合亲和力密切相关，AT重复次数达到4次即可有效触发扩增。
图2 基于短串联重复的自模板引物诱导的等温扩增原理及相应琼脂糖凝胶电泳分析。A) AT12或GC12诱导的等温扩增机制及预期反应步骤。B) GC12和C) AT12在不同温度下超过60分钟的扩增性能。D) AT12在37°C和E) 65°C下的扩增性能。F) 65°C和G) 37°C下使用PCR仪评估AT12和GC12的扩增动力学。缓冲液中包含10,000倍稀释的SYBR Green I染料用于扩增信号输出。自模板引物浓度：50 nM；Bst DNA聚合酶：0.3 U/μL；dNTPs：1.2 mM。为获得更好扩增性能，GC12反应缓冲液中不含dATP或dTTP，AT12反应缓冲液中不含dGTP或dCTP。
图3 串联重复长度对扩增的影响。A) 不同长度AT引物的扩增性能。扩增缓冲液中不含dGTP或dCTP。B) 不同长度GC引物的扩增性能。扩增缓冲液中不含dATP或dTTP。不明显扩增产物用红虚线框标出。C) 固定长度（10 nt）复合引物的扩增性能。扩增缓冲液中不含dGTP或dCTP。D,E) 不同长度自模板引物的熔解曲线。自模板引物：1 µM。荧光信号来自SYBR Green I（1:10,000稀释）。纵轴（dF/dT）表示荧光信号随时间的变化率。F) 自模板引物与Bst之间相互作用亲和力的EMSA分析。自模板引物：1 µM；Bst：2 U/µL。引物-Bst复合物位置用红虚线框标出。荧光信号来源于FAM。
利用AT12自模板引物进行等温扩增后，产物通过链间交联形成网络结构，成功构建出DNA水凝胶。原子力显微镜图像显示产物具有清晰的网络形态，扫描电镜图像则展示了典型的3D交联结构，孔径多在100 μm以下。流变学测试表明，水凝胶在不同剪切应变下储存模量和损耗模量保持稳定，具备良好的机械性能。
图4 自模板引物制备的DNA水凝胶。A) 使用AT12制备DNA水凝胶的过程。B) AT12制备的扩增产物的AFM图像（50 nM，30分钟，65°C）。C) AT12制备的脱水DNA水凝胶的SEM图像。DNA产物浓度为12 µg/µL。D) DNA水凝胶（DNA浓度：2、8和12 µg/µL）的储存模量（G′）和损耗模量（G″）随剪切应变的变化。
为进一步提升材料的结构扩展性与强度，研究人员将自模板引物接枝至Y型DNA自组装模块中，提出了“基于自模板引物的分支等温扩增”策略。通过该策略制备的水凝胶显示出更致密的DNA网络结构，并在相同DNA浓度下表现出更高的材料强度，SEM和流变学测试结果均验证了其优异的交联形态和力学稳定性。
图5 Y型模块制备的DNA水凝胶。A) 使用Y型模块制备DNA水凝胶的过程。照片显示一块DNA水凝胶粘附在移液器吸头。B) Y型模块制备的扩增产物的AFM图像（50 nM，30分钟，65°C）。C) Y型模块制备的脱水DNA水凝胶的SEM图像。DNA产物浓度为12 µg/µL。D) DNA水凝胶（DNA浓度：2、8和12 µg/µL）的储存模量（G′）和损耗模量（G″）随剪切应变的变化。
在生物安全性方面，该DNA框架水凝胶在细胞和动物层面均表现出较高的生物相容性与低免疫原性。研究人员进一步将水凝胶负载小分子药物（Bergamottin, BM）和核酸药物（重组miR-138-5p拮抗剂, RMA），用于处理人间充质干细胞。实验结果显示，负载药物的水凝胶能够持续释放药物，并显著促进细胞的成骨分化，表现为碱性磷酸酶活性升高、Alizarin Red S染色增强以及成骨标志基因（Alp和Runx2）表达上调。
图6 DNA框架水凝胶（DFH）在体外可携带并持续释放药物。A) 通过将冻干DNA用含BM或RMA的PBS重构，随后与培养基（800 μL）和hMSCs混合，并在37°C孵育72小时，制备载药DNA水凝胶（200 μL）。B)至E) 使用ALP、ARS和qPCR评估细胞成骨分化水平（平均值±标准差，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）。DNA水凝胶：8 μg/μL；BM：30 mM，PVAm：0.3 mg/mL，MSA：20 μM，RMA：20 μM。hMSCs数量：5 × 10⁵。
在动物实验中，将载药DNA水凝胶注射至小鼠股骨骨髓腔和颅骨皮下空间，结果均显示BM和RMA能显著促进骨形成，钙黄绿素标记和矿物沉积率结果进一步证实了其在体内的成骨促进作用。同时，水凝胶对小鼠主要器官及肝肾功能未产生明显影响，显示出良好的体内安全性。
图7 DNA框架水凝胶（DFH）在体内可携带并持续释放药物。A) 通过BIS制备的DFH（20 μL）分别与10 μL BM或RMA混合。随后将载药DFH注射至小鼠股骨骨髓腔和颅骨皮下空间，持续3周。B) 股骨和C) 颅骨的钙黄绿素标记及矿物沉积率结果（平均值±标准差，***p < 0.001）。DNA水凝胶：8 µg/µL；BM：30 mM，PVAm：0.3 mg/mL，MSA：20 µM，RMA：20 µM。
总之，本研究通过自模板引物驱动的等温扩增策略，成功实现了DNA框架水凝胶的高效、低成本制备，并展示了其在药物载体与组织再生方面的应用潜力。该工作为DNA纳米材料的微观结构设计与功能化提供了新思路，有望推动DNA水凝胶在临床诊断与治疗中的进一步应用。
来源：高分子科学前沿
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