顺行跨多突触示踪（Anterograde Transsynaptic Tracing）是一种神经环路追踪技术，能够从起始神经元出发，沿轴突方向顺向传播并跨越一个以上的突触，标记其下游的多级神经元。该技术用于绘制大脑中“从A到B再到C”的输出型神经通路，揭示特定脑区或细胞类型的多级下游靶点。
案例解析
《A Central Amygdala Input to the Parafascicular Nucleus Controls Comorbid Pain in Depression》
科学问题：
在抑郁共病疼痛（CP）研究中，已知中央杏仁核（CeA）与疼痛调节和情绪处理密切相关，但CeA神经元具体如何投射到下游脑区，进而影响疼痛相关信号的处理尚不明确。
采用单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）株 H129-G4作为顺行跨多突触追踪病毒。该病毒具有顺向（从胞体向轴突末梢）、跨多突触传递的特性，可通过在起始脑区（CeA）注射，随神经元轴突传递至直接或间接连接的下游脑区且病毒携带绿色荧光蛋白（GFP）基因，感染后可通过荧光信号可视化被标记的神经元及投射纤维。
实验步骤
（1）动物准备与麻醉
选择野生型 C57BL/6J 小鼠（8-10周龄雄性）作为实验对象，实验前将小鼠置于立体定位仪中，采用赛拉嗪（10 mg/kg）与氯胺酮（100 mg/kg）混合麻醉并通过加热垫维持小鼠核心体温在 36℃，确保手术过程中动物生理状态稳定。
（2）病毒注射与定位
脑区坐标确定：根据小鼠脑图谱，设定 CeA 的立体定位坐标。
病毒参数与注射：使用校准的玻璃微电极连接微量注射泵，向 CeA 注射300 nL H129-G4 病毒，注射速率控制为 30 nL/min，避免过快注射导致局部脑组织损伤或病毒扩散范围异常。注射完成后，停留 5-10 分钟再缓慢拔出微电极，确保病毒充分留存在 CeA 区域。
（3）病毒传递与样本制备
等待期：注射后将小鼠单笼饲养，给予充足水粮，维持 12 小时光暗周期（7:00-19:00 光照），等待36 小时以保证病毒完成顺行跨多突触传递：此时间窗口经预实验验证，可在下游脑区观察到清晰的 GFP 荧光信号，同时避免病毒过度扩散。
灌注与切片：36 小时后，采用戊巴比妥钠（20 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉小鼠，通过心脏灌流依次注入 0.9% 生理盐水（冲洗血液）和 4% 多聚甲醛（固定脑组织）；取出脑组织后，在 4% 多聚甲醛中过夜后固定，再用 30% 蔗糖溶液进行冷冻保护，最后使用冷冻切片机将脑组织切成 40 μm 厚的冠状切片，覆盖包含 CeA、PF、S2 等脑区的范围。
（4）荧光观察与验证
将切片进行荧光染色后，使用Zeiss LSM710 共聚焦显微镜观察 GFP 信号分布：
在 CeA 注射位点（起始区）可观察到大量 GFP⁺神经元胞体，确认病毒成功感染起始脑区；
在下游脑区中，除观察到已知的疼痛相关脑区（如未定带 ZI、腹外侧导水管周围灰质 vlPAG）外，仅在 PF 区检测到 GFP⁺神经元且这些神经元与谷氨酸抗体（识别 Gluᵖᶠ神经元）共定位，初步证实 CeA 神经元通过跨多突触传递投射至 PF 区的 Gluᵖᶠ神经元；
Fig1 顺行跨多突触示踪技术探究CeA与PF等脑区的神经投射关系
图A为顺行跨多突触追踪实验设计，在C57小鼠CeA注射H129 - GFP4病毒；图B显示病毒在CeA的注射位点及顺行传递至PF区的情况；
图C表明CeA顺行跨多突触投射到PF区的是谷氨酸能神经元；
顺行跨多突触追踪主要用于明确CeA神经元的下游投射靶点，尤其是定位到丘脑束旁核（PF）及次级躯体感觉皮层（S2）等与疼痛信号处理相关的脑区。
顺行跨多突触技术能够从起始脑区（CeA）出发，随着神经元轴突传递至直接或间接连接的下游脑区。如研究中通过向 CeA 注射 H129 - GFP4 病毒，成功追踪到该病毒顺行跨多突触传递至丘脑束旁核（PF）区 ，明确了 CeA 存在向 PF 的投射，为后续解析完整的神经通路提供了关键线索。
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确定投射神经元类型
在明确神经投射关系的基础上，还需要确定投射到下游脑区的神经元具体类型，以便深入理解神经信号传递和调控机制。
结合免疫荧光染色等方法，该技术可以在追踪神经投射的同时，对被标记的神经元进行细胞类型鉴定。例如，在 PF 区观察到被 H129 - GFP4 病毒标记的 GFP⁺神经元，通过与谷氨酸抗体共定位分析，证实 CeA 通过顺行跨多突触投射到 PF 区的神经元为谷氨酸能神经元（Gluᵖᶠ），这对于理解该通路在疼痛信号处理中的作用至关重要 。
提供完整神经环路研究基础
解析调控 CP 的核心神经环路，需要全面了解各脑区之间的连接关系。
后续可通过单突触追踪实验（如 Cre 依赖型狂犬病毒追踪）进一步验证该投射的直接性。
顺行跨多突触追踪结果还可与后续逆行单突触追踪等技术相结合，从不同方向验证和补充神经环路信息。例如：可结合电生理记录明确该通路的电生理功能；结合光遗传学调控该通路功能等。
文献引用：
Zhu X, Zhou W, Jin Y, Tang H, Cao P, Mao Y, Xie W, Zhang X, Zhao F, Luo MH, Wang H, Li J, Tao W, Farzinpour Z, Wang L, Li X, Li J, Tang ZQ, Zhou C, Pan ZZ, Zhang Z. A Central Amygdala Input to the Parafascicular Nucleus Controls Comorbid Pain in Depression. Cell Rep. 2019 Dec 17;29(12):3847-3858.e5. doi: 10.1016/j.celrep.2019.11.003. PMID: 31851918; PMCID: PMC7020652.
Assous M, Kaminer J, Shah F, Garg A, Koós T, and Tepper JM. (2017). Differential processing of thalamic information via distinct striatal interneuron circuits. Nat. Commun 8, 15860.
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