前言
南美白对虾（Litopenaeus vannamei）占全球虾养殖量的75%以上，但养殖业的扩大导致疾病增加，尤其是弧菌病。可持续的解决方案是选择抗病品种，而不是过度使用抗生素。一项新研究首次分析了LvLTLC1基因启动子区域，发现SNPs与许多弧菌物种的抗性状相关，为选择品种增加抗性品系虾苗开辟了方向。
一、材料和方法：
实验虾和易感性：从4个养殖场共采集了200只尾虾（10g-15g），并在800L的水箱中临时饲养。此外，还收集了来自4个养殖场的308尾个体作为验证组（VAL）。取肝胰腺样本（0.1 g）以量化弧菌负荷（VL）；将肝胰腺和肌肉残骸储存在–80°C以供
进一步分析。
弧菌负荷的测定：将肝胰腺样品均质化、稀释，然后在TCBS上培养以计算菌落计数（CFU/g）。根据VL，选择20名耐弧菌个体（VR，最低10%）和20名易感个体（VS，最高10%）进行分析。
实时PCR和数据分析：分离肝胰腺总RNA，合成cDNA，RT-qPCR（β-actin作为参考基因）定量LvLTLC1基因表达。使用Pearson相关系数（SPSS 27.0）分析LvLTLC1 mRNA表达与VLs mRNA表达之间的相关性。
PCR扩增和测序：分离VR组和VS组各20例DNA的DNA，扩增至LvLTLC1启动子区，采用SnapGene 6软件对PCR产物进行电泳、测序和SNP鉴定。
SNP和单倍型分析：比较两组之间的SNP基因型。选取差异明显的SNPs（P < 0.05）分析与综合耐弧菌（PVR）性状的关联。使用Haploview分析不平衡（LD） 链路。
Val确认：VAL组中的308名个体通过PCR进行基因分型，并测序以确认SNP/单倍型与PVR之间的关联。遗传多样性参数（Ne，Ho，He，等位基因频率，PIC）使用Popgene 32计算。使用SHEsis PLUS进行Hardy-Weinberg测试。
预测转录因子 （TF） 的附着位置：使用贴片系统和JASPAR数据库分析启动子区域中的核心调节元件。预测评分为 >85%的TF被认为可用于评估基因调控中的潜在作用。
二、VR组和VS组PVR性状表达及LvLTLC1基因水平结果
根据肝胰腺VLs，筛选出20例耐弧菌个体（VR、VLs<10⁴ CFU/g）和20例易感个体（VS、VLs>10⁷ CFU/g）。结果显示，肝胰胰组VR的LvLTLC1基因表达水平明显高于VS组。此外，LvLTLC1表达与VL呈负相关，证实了该基因在弧菌耐药机制中的重要作用。
图1. VS和VR组中的 VL。（A）VR组和VS组的VL统计。（B） VR和VS组典型个体的 VL。
图2. VS组和VR组LVLTLC1基因的mRNA表达及其与VL的相关性。（A）VS组和VR组LvLTLC1基因表达。（B）基因表达与VL的相关性分析。
1、LvLTLC1启动子区SNPs的检测及与PVR性状的关联：
与LvLTLC1参考序列相比，VR组和VS组鉴定出24个SNP位点不同，均位于潜在转录因子集中的500 bp启动子区域。其中，只有SNP8 （g.–256 A/G） 和SNP16 （g.–116 A/G） 具有统计学意义的基因型差异。值得注意的是，SNP8的GG纯合基因型仅出现在三个VR实例中，并且不存在于VS组中。相比之下，SNP16虽然在两组之间不同，但没有PVR相关基因型；SNP16的AG基因型与易感性状相关，见于91.6%的VS个体。因此，SNP16不是PVR性状的可靠指标，但可能与易感性有关。在所有SNPs中，SNP8的P值最低，表明SNP8的GG纯合基因型是与虾中综合抗弧菌（PVR）性状相关的分子指标的潜在候选者。
图3. 引导区的4个SNP位点在VR组和VS组中具有不同的基因型。
2、LvLTLC1启动子区单倍型及与PVR性状的相关性分析：
LD分析表明，SNP9和SNP10具有高度的关联性，因此将这两种SNP的单倍型纳入与PVR性状相关的分析中。结果记录了5例携带TG单倍型的个体，其中4个个体（80%）属于VR组，只有1个个体（20%）属于VS组。这表明TG单倍型与弧菌抗性有关，并可能作为虾PVR性状的潜在分子指标。
3、基于SNP8的VAL组遗传多样性参数：
以308尾虾个体为基础的VAL组进行SNP8的遗传多样性分析，与PVR性状的关联最强。基因分型结果用于计算等位基因频率和遗传参数，检验表明SNP8遵循 Hardy-Weinberg 平衡 （HWE）。同时，SNP8的多态性水平较低（PIC < 0.25），反映出该位点的遗传变异很少见，与PVR性状在虾种群中本质上罕见的观察结果一致。这些结果加强了SNP8的遗传基础，表明它是PVR性状的潜在分子标记。
图4. LvLTLC1基因起始区24个SNP位点的基因型。红色表示强LD，方形表示 LD SNP。
4、验证VAL组候选基因型/单倍型与PVR性状之间的关联：
在308尾个体的VAL组中，PVR性状根据弧菌负荷（VLs）分为10个目，范围从10³到1.65×10⁷ CFU/g，标准分布，经Q-Q检验确认。这表明PVR性状多种多样，从强抵抗力到易感性，但极端情况很少见。SNP8基因型分析显示，3种基因型VLs差异明显（P < 0.01）。携带G等位基因（AG 或 GG）的个体的VL明显低于 AA，并且VL随着G等位基因数量的增加而减少。特别是，GG基因型与极低水平的VL （<10⁴ CFU/g） 相关，表现出高耐药性。对于SNP9和SNP10，VAL组的LD分析显示强烈的结合失衡（D' = 0.922）。TG单倍型的VL明显低于其他单倍型，特别是当TT/GG组合时，具有该基因型的两个个体被归类为具有VLs<10⁴ CFU/g的PVR。TT/AG基因型的VL也低于大多数其他单倍型，尽管高于 TT/GG。结果表明，SNP10的纯合状态在SNP9-SNP10结合作用中起重要作用。综上所述，SNP8（特别是GG基因型）和TG单倍型（SNP9-SNP10）是与斑节对虾综合抗弧菌（PVR）性状相关的潜在分子标记。
图5. VL VAL组中的分布。（A） VL 频率图。随着颜色变深，感染也会增加。（B） 标准配电检查的Q-Q图表。
图6. VAL组基因型、单倍型和VL之间的相关性。（A）VL与SNP8（B）VL中不同基因型个体的分布以及SNP9和SNP10中不同单倍型个体的分布。
图7. SNP9和SNP10的TG单倍型的基因型组合与VL有关。基因型组合后面括号中的数字表示个体的大小。
5、SNP突变改变转录因子 （TF） 的内聚模式：
JASPAR的预测分析（相对评分>0.85）表明，LvLTLC1启动子区域的SNP变异导致能够附着在基序上（TFBS）的TF数量和类型发生变化。在 SNP8 （g.–256） 中，A等位基因产生四个预测的TF，属于三个家族（FAEOB II、MYB62、STAT3 和 MOT3），而G等位基因产生三个完全不同的 TF（STAT3、Fox A-b、tbx-37）。在 SNP9 （g.–249） 处，T等位基因产生三个家族的四个TF，而G等位基因产生两个家族的5个TF，包括具有扩展结合位点的TF DOF5.7。在SNP10 （g.–235） 中，A等位基因产生两个家族的四个TF，但G等位基因只有两 TF。值得注意的是，SNP10中的A→G转化也改变了TF STAT3识别基序序列。这些结果表明，启动子区域的SNPs可以改变TF附着模式，从而影响对虾LvLTLC1基因表达和PVR性状的调控。
图8. 转录因子的预测分析。（A）与含有SNP8、SNP9和SNP10的基序相关的多个转录因子家族。（B）SNP影响同一家族的转录因子结合基序。
三、结束：
本研究首先研究了南美白对虾LvLTLC1基因启动子区的SNP，共检测到24个SNP位点。特别是，SNP8的GG纯合基因型 （g.–256 A/G） 与较强的弧菌抗性密切相关。LD分析表明，SNP9（g.–249 T/G）和SNP10（g.–235 A/G）高度相关，TT/GG基因型组合具有明显的内聚力和较强的抗性。因此，将SNP8的GG基因型和SNP9和SNP10的TT/GG组合确定为综合抗弧菌（PVR）的2个潜在分子标记，在对虾遗传品种的选择中具有应用价值。
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