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MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）是分子进化分析专用集成软件，以图形化界面简化生物信息学分析流程，无需编程基础即可完成序列比对、进化树构建、遗传距离计算等核心操作，广泛应用于病毒溯源、物种分化、基因家族进化等研究领域。其核心优势在于：
支持核苷酸 / 蛋白质序列全流程分析，功能覆盖从数据预处理到结果可视化；
集成邻接法（NJ）、最大似然法（ML）等主流建树算法，适配不同研究需求；
跨 Windows、MacOS、Linux 系统，且完全免费开源。
核心功能一：多序列比对
多序列比对是系统发育分析的前置核心步骤，需确保序列同源性区域对齐。MEGA 支持 ClustalW、MUSCLE 两种主流算法，以下以常用的 ClustalW 比对核苷酸序列为例：
数据准备：
支持格式：优先使用 Fasta 格式（最通用），也支持 Clustal、GenBank 等格式；
数据来源：可从 NCBI GenBank 数据库下载目标序列（主要有核酸序列和蛋白质序列），或使用实验室测序数据。此处以 TP53 蛋白序列为例，尽量选择大小相近的蛋白，然后在右上角的 send to 选择 FASTA 格式下载。
2. 详细比对步骤：
导入序列文件：点击主界面「File → Open a File/Session」，选择准备好的 Fasta 文件；
在弹出窗口中选择 Align；
然后进行序列规整，单击菜单【Alignment】→【Align by ClustalW】，弹出参数设置窗口，保持默认参数（新手推荐），关键参数说明：
Gap Opening Penalty：10（间隙打开罚分，数值越大越难出现间隙）；
Gap Extension Penalty：0.2（间隙延伸罚分，数值越小间隙越长）；
DNA Weight Matrix：IUB（核苷酸比对默认矩阵）；
点击「OK」，等待比对完成（进度条显示，小规模序列需 1-3 分钟）。
比对结果检查与调整：比对完成后自动显示对齐的序列；
检查要点：
同源区域是否连续对齐（无大量错位间隙）；
两端冗余序列是否过多（可手动裁剪）；
手动调整：选中错位区域，右键选择「Delete」删除无效列。
最后单击菜单【Data】→【Save Session】，保存序列比对的结果。
核心功能二：系统发育树构建
MEGA 支持邻接法（NJ）、最大似然法（ML）、最小进化法（ME）等，其中邻接法（NJ）计算快、适用性广，适合新手入门；最大似然法（ML）精度更高，适合发表级分析。下面是具体操作步骤：
1. 把上面保存的 meg 文件拖拽到 MEGA 软件中。
2. 点击 Phylogeny—— 选择近邻法绘制进化树（Construct/Test Neighbor-Joining Tree），弹框选择 yes；
3. 参数设置（关键！影响建树可靠性）：
弹出「Analysis Preferences」窗口，按以下推荐设置：
Test of Phylogeny：选择「Bootstrap method」（自举检验，评估分支可靠性），设置「Bootstrap replications」为 1000（推荐值，重复 1000 次检验，数值越高越可靠）；
Model/Method：选择遗传距离模型，核苷酸序列推荐「Kimura 2-parameter」（K2P 模型，考虑碱基转换 / 颠换差异），蛋白质序列推荐「JTT」模型；
Rate among Sites：新手保持「Uniform rates」（均匀速率，复杂分析可选 Gamma 分布）；
Gaps/Missing Data：选择「Pairwise deletion」（成对删除含缺失数据的位点，保留更多有效数据）；
点击「OK」开始计算。
4. 结果解读与可视化：
计算完成后自动弹出结果窗口，显示 NJ 树，可以在上方选择树的样式，例如绘制一个圆形的树，或一个经典的树：
核心元素解读：
叶节点：代表输入的物种 / 序列（标注名称与 accession 号）；
内部节点：代表推测的共同祖先；
分支长度：表示进化距离（数值越小亲缘关系越近）；
Bootstrap 值：分支上的数字（0-100），≥70 表示该分支可靠性高；
5. 结果保存：（适配期刊要求）
导出树形文件：点击「File → Export Current Tree」，选择：
Newick 格式（*.nwk）：用于其他软件（如 FigTree）进一步编辑；
MEGA 格式（*.mts）：保存当前会话，便于后续修改。
导出图片：点击 Image，选择高分辨率格式，推荐 PNG（300 DPI）或 TIFF（600 DPI，发表首选）；
常见问题与避坑指南（Q&A）
1. 序列比对乱序，无法建树？
可能原因：序列同源性过低（<50%）或格式错误；
解决方法：
① 用 NCBI BLAST 验证序列同源性，剔除异源序列；
② 检查 Fasta 格式，确保每个序列的「>」后无空格，序列无换行错误。
2. Bootstrap 值普遍偏低（<50）？
可能原因：序列长度过短、样本量不足或比对质量差；
解决方法：① 增加序列长度（≥500bp）；
② 补充近缘物种序列；
③ 重新优化比对（删除冗余间隙列）。
3. 建树时提示 「内存不足」？
可能原因：序列数量过多（>100 条）或序列过长；
解决方法：① 分批次分析，先构建核心物种树；
② 关闭其他软件释放内存；
③ 选择计算更快的 NJ 法替代 ML 法。
4. 如何选择遗传距离模型？
核苷酸序列：默认 K2P 模型（通用），若 GC 含量差异大，选 GTR 模型；
蛋白质序列：默认 JTT 模型，若含跨物种序列，选 WAG 模型；
5. 打开 FASTA 文件后，序列名称只显示一部分是什么原因？
可能原因：这是 MEGA 的默认设置，序列名称会显示到第一个空格为止。
解决方法：无需修改文件，点击软件中 「display -> show full sequence names」 选项，即可显示完整的序列名称，避免因名称显示不全误判序列。
6. 报错「Error: MEGA has detected duplicate taxa labels」 该如何处理？
可能原因：该报错是样本分类单元标签重复导致软件无法区分不同样本。
解决方法：提前检查序列文件中所有样本的名称，确保每个标签唯一，可通过添加序号、物种亚种信息等方式修改重复标签，修改后重新导入数据即可。
现添加下方企微，任何实验相关问题都可以咨询哦
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题图来源：自制
编辑：冷漠小 z
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