单纯疱疹病毒是人类最常见的病毒之一，含有8种亚型，90%以上的人群至少感染其中一种单纯疱症病毒。总结疱疹病毒学知识以形成自己的思路是很有必要的。因为是科学性总结，所以不会像文学作品或者小说那样富有情节。但是我们会采用小说的写作手法，力争在尊重科学事实的基础上做到严谨、有料、有味。为做到简洁，不再插入文献。不做特别说明的话，这里的病毒是指Ⅰ型人类单纯疱疹病毒（HSV-1）。内容以李琦涵、姜莉编著的《人类疱疹病毒的病原生物学》绿皮书为依据，参考著名病毒学家Bernard Roizman、David M. Knipe等主编的《费氏病毒学》，舒红兵教授主编的《抗病毒天然免疫》。
好了，开始！
第一章 病毒入侵
事实上，病毒入侵是一个复合的概念。既可以是机体水平上（我们通常称作感染），也可以是细胞水平。不过，通常意义上的病毒入侵是指病毒颗粒进入细胞的过程。下面，我们对两个过程都做介绍。仔细想想，其实这两个过程并不矛盾，因为病毒入侵是先要通过机体的防线，再进入易感性细胞并最终完成其复制周期。
呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜以及体表的皮肤构成机体防止病毒入侵的物理屏障。同时，生物体还可以分泌能够抵抗病毒感染的小分子多肽，如防御素（defensin）、溶菌酶（lysozyme）、导管素（cathelicidin）等组成机体防御的化学屏障。宿主对病毒的免疫反应是天然免疫的第三道屏障。这些屏障共同组成机体抵抗病毒入侵的第一道防线。但是，病毒很狡猾，可以突破这些屏障，从而进入机体。
疱疹病毒是一类以潜伏感染而著称的病毒。它们有着自己的生存周期，从生到死，跟人类是一样一样滴。在病毒的复制周期中，病毒通过细胞膜进入细胞是非常关键的一个环节，因为没有入侵就没有后面的故事。现在，咱们就详细说说病毒通过细胞膜进入细胞的全过程吧。相对于人体细胞而言，病毒很小很小，基本上是乒乓球或玻璃球与篮球的关系。
疱疹病毒颗粒的整体直径为170~200nm（平均直径185nm，加上棘突会增至225nm），而在人体细胞中，卵细胞平均直径200μm，神经细胞为100um（长度可达0.7~1m），红细胞为7um，白细胞为3~4um。因此，从体积的角度看，病毒颗粒与宿主细胞可以看成乒乓球和篮球，也就是说，对病毒来说，细胞是个庞然大物。那么，病毒是怎样进入细胞这个“庞然大物”的呢？简单地说，这是由病毒囊膜蛋白及其定位于细胞表面的受体决定的。
如前所述，人体的所有细胞（器）表面都存在很多分子。免疫细胞（器）的表面分子能够识别病原相关分子模式（PAMP），通常被称为模式识别受体（PRR），可以特异性地识别“危险信号”，启动机体的免疫应答。一般情况下，非免疫细胞不参与免疫应答。事实上，在长期的进化中，病毒正是利用这些表面分子入侵宿主细胞的。
在病毒学中，能够直接与天然病毒粒子结合的细胞表面分子通常被称为病毒受体（viral receptor）；能够通过其他分子间接与天然病毒粒子或与第一步结合后已发生构象改变的病毒粒子结合的细胞分子称为共受体（coreceptor）。共受体可以是细胞表面分子，也可以是游离的细胞分子。病毒受体和共受体是病毒嗜性（viral tropism）的主要因素，是病毒感染早期的关键步骤，也决定病毒能否入侵细胞，因为病毒不能通过细胞脂质双分子层直接进入细胞。
读到这里，很多人肯定会产生困惑：宿主细胞可对入侵的病毒产生免疫应答，同时，病毒又能通过受体和共受体进入细胞，这难道不是悖论吗？当然不是，因为发挥免疫应答的是免疫细胞，而病毒入侵的细胞大多是非免疫细胞，这两类细胞的表面分子是不一样的。类似的情况是外敌（病毒）入侵时，普通老百姓（非免疫细胞）和军队（免疫细胞）的反应是不一样的，因为老百姓没有防御能力，而军队是配有武器的，是可以直接反击的。为了方便理解和情节的叙述，咱们先从宿主细胞的免疫应答开始吧！
在所有的信号通路中，目前研究最为透彻的是TLRs。TLR在免疫细胞中均高水平表达，而在非免疫细胞中表达较少。迄今已经报道的人类TLR家族成员有11种，且均为跨膜蛋白。TLR分子在细胞内的分布有所不同，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于细胞膜，而TLR3、TLR7、 TLR8和TLR9定位于细胞内体膜上。不过，在抗HSV-1感染中，主要是TLR2、TLR3和TLR9参与识别和抵御，而且整合素或许在其中发挥调节作用。
另外，尽管HSV-1病毒是dsDNA病毒，其复制周期中也会产生dsRNA，后者进一步激活RLR信号通路，即RIG-I和MDA5信号通路。同时，病毒入侵引起的危险信号也会激活NLR信号通路，但是关于HSV-1感染与NLR信号通路的研究还比较少。关于HSV-1与天然免疫其他识别受体关系的研究则主要集中在DNA受体家族上，而不是C型凝集素受体家族或其他固有免疫特异性PRRs。HSV-1是dsDNA病毒，因而研究DNA受体的意义要比其他识别受体意义深远。
然而，这一切并不是病毒的本意，它们并不是要激活机体的天然免疫系统，而是要入侵人体的细胞并建立潜伏感染和再激活的裂解性感染，从而把自身的基因组DNA传递下去。因而，在机体免疫系统激活的同时，有些病毒微粒则逃过宿主的攻击，在机体粘膜或体表的表皮细胞完成裂解性感染，其中又有一些沿着末梢神经并上行至机体的三叉神经节和背根神经节等神经中“潜伏”下来。然而，无论是表皮细胞还是神经细胞，它们自身的防御能力是极其有限的。病毒恰恰是利用这些非免疫细胞的低防御的弱点入侵细胞的。那么，具体入侵过程是怎样的呢？病毒受体和辅助受体！
基于现有的研究资料，我们可以根据疱疹病毒感染所引起的病理形式大体将其分为两类，即溶胞性感染和潜伏性感染：前者主要是疱疹病毒针对上皮细胞、成纤维细胞等所产生的感染形式；而后者则多见于神经细胞和淋巴细胞的感染。为什么疱疹病毒可以在同样的机体环境中导致这样两种截然不同的感染形式，到目前为止尚无完善的解释。
通常情况下，病毒是以液晶态的形式存在的，而不是细胞似的固态。最初的相互作用是静电引力吸引，这一阶段可逆、不稳定。随后，病毒能够借助其表面的囊膜蛋白与细胞受体识别结合（粘附），然后通过膜融合（病毒囊膜与细胞膜都是双层脂膜）入侵宿主细胞。这一过程，相对稳定、不可逆。
对HSV-1病毒吸附宿主细胞膜表面受体的研究表明，HSV在进入细胞的过程中，要通过膜蛋白和多个细胞受体、辅助受体的结合，才能完成其介导病毒囊膜与细胞膜融合并使病毒进入细胞的任务 。这样的功能要求，使得病毒糖蛋白的多种糖蛋白分子必须综合发挥互补作用。对此，现有的模型认为，HSV在吸附细胞膜表面时，首先是糖蛋白gC和/或gB与细胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特异性结合，这种结合使得病毒囊膜与细胞膜的空间距离缩短。随后，gD则与胞膜上的特异性受体结合，后者可能为HVEM（Herpes virus entry mediator，肿瘤坏死因子家族成员），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成员），还可能是由3-O-磺基转移酶催化硫酸肝素黏分子而产生的异构体（3-OST-3）。这些结合进一步启动gH、gL ，可能还有gK等，与上述蛋白一起，发挥促进介导病毒囊膜与细胞膜融合的作用。在此过程中，还可能形成脂代结构的（胆固醇和鞘磷脂分子富集而形成特定的微结构域），实际上可以使膜内的相应受体蛋白发生动力学变化，以促进囊膜与胞膜的融合。同时，还可能引发某些特定的胞膜信号受体分子的结构运动，从而向细胞内导入某些信号。
下面我们就以“Specific Association of Glycoprotein B with Lipid Rafts during Herpes Simplex Virus Entry”为例，探讨病毒糖蛋白gB在病毒入侵细胞的具体作用。（在入侵过程中，宿主细胞中信号通路的激活以及其他囊膜蛋白的功能不是我们这里讨论的重点。）
Bender 等人发现用胆固醇或脂类螯合剂处理细胞后，病毒感染细胞的能力明显下降；再加胆固醇做Rescue实验时，病毒的感染能力又恢复到正常水平。但是，病毒感染之后，再用胆固醇或脂类螯合剂处理细胞时，病毒的复制并不受影响。因此，他们推断，细胞表面的脂类和胆固醇分子与病毒入侵密切相关，但是与病毒的复制无关。我们已经知道，病毒通过糖蛋白与细胞特定的受体识别、结合进入细胞，那么病毒的糖蛋白与胆固醇或脂类有什么样的关系呢？他们用梯度离心法获得脂类密集区域（即脂滴）可能含有或结合的病毒蛋白或细胞蛋白，然后用WB检测。实验发现，脂滴中并不含有病毒蛋白受体HVEM和nectin-1，但是他们检测到了病毒蛋白gB。因此，他们推断，gB与脂滴中的某种成分（或许是受体）相互作用，从而介导病毒入侵宿主细胞。这样，我们也就更加接近真理。后来，Bender等人获得了gB的晶体结构，并在Science上发表文章。当然，这些都是后话。那么，结合教材和文献，我们可以推断病毒入侵宿主细胞的大致过程：
人物：四处游荡（布朗运动）的屌丝（病毒分子），朝九晚五的女白领（细胞）。
场景：屌丝走路从来不看路，一不小心，屌丝撞到了下班赶公交的女白领（女白领的车钥匙忘记带了所以只得挤公交；不过，今天工作进展顺利，虽是挤公交，她也很高兴，以致被屌丝撞了一下还能还以微笑）屌丝爱上了女白领，狂追不舍，并最终以身相许。
情节：病毒蛋白通过静电作用与宿主细胞在空间上接近，随后，病毒通过其囊膜蛋白gB和gC与细胞表面的硫酸肝素糖分子非特异性结合。但是，这种结合并不稳定。紧接着，病毒发生构象调整，并通过gD与其受体HVEM（或者是nectin-1，亦或是3-OST-3)结合，此时的结合是特异性结合，结合牢固。这样，粘附（Attachment）任务就完成了。接下来，gB与脂筏上的特定受体结合并触发囊膜-细胞膜融合事件，同时，gH/gL异源二聚体被招募到融合起始处，gE、gG、gK、gJ也相继加入。所有的病毒蛋白相互合作，协同完成病毒的入侵（Entry)。随后，病毒脱掉囊膜，皮层蛋白、核衣壳及其包裹的核酸进入宿主细胞，即产生一个跟HSV-1入侵免疫细胞截然不同的结果。
第二章 高速公路
在上一节中，我们重点阐释了HSV-1通过细胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）、HVEM、免疫球蛋白超家族成员（nectin1和nectin2）进入细胞的过程，而没有展开整联蛋白在其中的重要作用。研究证明，HSV-1、HCMV及HHV-8等整联蛋白均可以通过细胞表面的整联蛋白进入细胞。整联蛋白及其偶联蛋白FAK、GRAF、Rho-A等激活，常常可以引起细胞内微管动力系统的功能变化。
真核细胞的骨架系统是由一大类纤维蛋白分子以不同形式组成的，其中包括肌动蛋白系统（MF）、微管系统（MT）和中间纤维系统（IF）。这些微管蛋白形成的骨架系统，一方面保证了细胞的特定结构和特定运动形式，另一方面也为细胞质内的各种生化事件提供了相应的网络骨架和区域，保证各种功能稳定有序进行；同时，这种结构也限制了某些大分子复合物（其大小范围在分子量500kDa和直径50nm以内）在细胞内的运动。病毒没有独自的细胞结构，必须借助宿主细胞的转录翻译系统，因此，病毒的遗传物质——dsDNA必定进入细胞核。显然，像疱疹病毒这种大分子复合物，当其从细胞膜移向其增殖复制区域——细胞核时，必定会受到胞内骨架结构的限制。病毒对此限制做出的反应，则是利用细胞内的大分子运输机理和自身的结构特点将其遗传物质移至核内。在此过程中，病毒蛋白自然会不可避免地与细胞的MF、MT和IF发生相应的作用。
事实上，对许多病毒的研究也确实提供了明确的证据。这些病毒既包括杆状病毒、痘苗病毒、SV40、腺病毒、HIV等，也包括疱疹病毒的多个成员，都能在进入细胞后以各种方式通过与MT、MF网络系统的相互作用以完成自身在细胞内的移动。实验表明，多聚纤维蛋白分子抑制剂可以阻断病毒在细胞内的运输作业，这充分证实病毒与此类蛋白的作用是病毒感染过程中的重要环节。【绿皮书 李琦涵】
我们以HSV-1为例讲述这方面的研究进展。
HSV-1的皮层蛋白VP22能够诱导MT的聚集，并通过其UL34基因编码的蛋白与细胞质内的动力蛋白的中间链发生相互作用。目前，HSV-1衣壳体借助微管蛋白系统向核内移动的前导事件还不清楚，但是电镜技术的连续观察分析显示，HSV-1在细胞核内向细胞核区域移动的过程的确与微管蛋白系统密切相关。首先，进入细胞的HSV-1衣壳体与微管的相关动力蛋白相结合；随后，衣壳体则沿着微管网络移向细胞核；在达到核膜时，HSV-1衣壳体则似乎是将所含的基因DNA注入细胞核内。
当然，形态学的观察还不能提供完全准确的结果。研究发现，当HSV-1衣壳体进入神经细胞后，细胞动力蛋白的亚基DHC、DIC和动力蛋白激活蛋白的亚基p150均聚集在衣壳体周围。此时，当使用动力蛋白抑制剂EHNA（erythro-9-3-[2-hydroxynonyl]adenine）处理细胞时，则可以明显阻断病毒在神经细胞中的感染。同时，其他实验还表明，当在细胞内过表达一种能破坏动力蛋白激活蛋白复合体的分子，同时也是动力蛋白激活蛋白亚基的dynamitin时，则使得HSV-1在细胞质内沿微管移动的速度和效率都大大降低。进一步的实验表明，与病毒衣壳体结合的细胞动力蛋白亚基DHC头部的结构域，可经ATP水解而产生构象变化，使其自身及与其结合的病毒衣壳体移向微管的负电荷端。此过程同时得到其他动力蛋白亚基DIC、DLIC和DLC的支撑作用。这一过程又得到动力蛋白激活蛋白的启动作用。这些资料均证明，HSV-1通过与微管及其相关蛋白的结合而获得趋向细胞核运动的动力，以实现自身到达细胞核的过程。【绿皮书 p158】
事实上，与微管结合、参与病毒移动的病毒蛋白均是由γ基因编码的衣壳蛋白，而与皮层蛋白和囊膜蛋白没有明显的关系。早期研究认为UL34编码的衣壳蛋白可能是与微管蛋白结合的主要分子，该实验发现，HSV-1进入细胞后，UL34蛋白会出现构象变化，并与UL31和ICP5相互作用而暴露于衣壳体表面。这些蛋白同时与微管蛋白相互作用，从而保证病毒移向细胞核区域。但是酵母杂交实验发现，UL35编码的VP26蛋白与动力蛋白轻链RP3和Tctex1之间的相互作用关系，进一步的结合实验和荧光分析也验证这一点。尽管其他衣壳蛋白如VP5、VP11/12也可能参与该过程，但是VP26仍发挥主要作用。虽然上述研究均提供详实的资料，但是对此机理的具体过程尚无定论。病毒沿着高速公路移动的过程看似简单，但是实际上极其复杂，还有待于更加深入的研究。包括UL34和VP5在内的衣壳蛋白在该过程中的作用也有待确认。
同时，从对病毒结构的初步分析中我们已经知道，疱疹病毒的结构组成包括几乎各部分，即基因组DNA、核衣壳、皮层蛋白和外膜。核衣壳是病毒毒粒结构的主要框架，它通常由10~20种蛋白组成（依据不同病毒而定），其中既有结构蛋白，也有与病毒DNA装载、核衣壳的形成相关的功能蛋白。核衣壳的外侧为皮层蛋白，它们占据了病毒囊膜包裹空间的1/3。这些皮层蛋白组成一种类似网状、没有明显分布规律的结构，具有重要的生物学功能和结构学意义（如VP16、UL41、UL37）。而最外层的囊膜则是一层来自宿主细胞质体膜的结构，但其上具有多种病毒糖蛋白(从gB到gN，没有gA和gF)，在病毒吸附细胞受体，进入细胞中发挥重要作用（咱们前面已经说过）。病毒在进入细胞时，棘突和囊膜会参与膜融合而被滞留在细胞膜上，因此实际上进入细胞的病毒成分是部分皮层蛋白、核衣壳及其包裹的基因组。
接下来，我们结合文献“Ultrastructural Visualization of IndividualTegument Protein Dissociation during Entry of Herpes Simplex Virus 1 into Humanand Rat Dorsal Root Ganglion Neurons”重点说一下皮层蛋白（核衣壳咱们放到后面说）在病毒移向细胞核过程的作用。
Anupriya等人采用广角反褶积显微镜和透射免疫电子显微镜这两种技术观察皮层蛋白VP16、VP22、UL36和UL37在病毒向细胞核移动过程中的角色。他们用标记荧光蛋白的病毒（比如把YFP连在VP16的N末端），那么病毒表达的VP16就带上了绿色荧光，然后用显微镜就可以看到了。WB（VP16一抗）检测发现，病毒感染细胞初期（0min），75%的病毒颗粒VP16阳性；在感染30min时，只有较少的病毒颗粒VP16阳性，而细胞质和胞膜上游VP16分布较多。在感染2~4h时，病毒颗粒VP16阴性，细胞质和核周有较多VP16分布。因此，在病毒移向细胞核的过程中，VP16从病毒颗粒上脱落，随后分布于细胞质和细胞核（VP16具有核定位信号，我们将在后面介绍其功能）。
因此，我们可以推断，在病毒从细胞膜沿着微管系统移向细胞核的过程中，大多数皮层蛋白病毒颗粒将脱落，暴露出核衣壳以便基因组释放进入细胞核。当然，这些皮层蛋白的具体功能还有待进一步研究，我们这里只是大体讲述皮层蛋白的综合效应。
第三章 基因组入核
病毒入侵细胞，在含有基因组的衣壳体从细胞膜融合处移至细胞核周围进入细胞核前，必须将其核衣壳体脱掉才能使其dsDNA通过核孔进入细胞核。基因组进入细胞核过程持续时间较短，因为病毒侵入细胞后即很快进入细胞核。这也说明，衣壳体很可能在移向细胞核的过程中即发生降解，或至少处于不稳定状态以便接近细胞核后基因组的迅速进入。
研究表明，衣壳体移至细胞核附近，与核孔蛋白复合体相互作用，而后者与衣壳体蛋白的结合进一步触发衣壳体的构象改变，从而促进其降解以及随后的基因组进入细胞核过程。进一步的实验则证明，衣壳体降解和基因组进入细胞核是密不可分的两个连续的过程。
现有数据已证实，衣壳体蛋白UL6、UL25在衣壳体复合物降解过程具有极为重要的作用，其他衣壳蛋白的作用还有待于进一步确认。而且，由于皮层蛋白与衣壳体蛋白的密切相互作用，UL36和其他皮层蛋白也可能参与其中。其中，关于UL25的研究较为清楚。实验发现，入侵宿主细胞后，疱疹病毒衣壳体沿微管网络移至细胞核并定位于核孔复合体，随后，病毒基因组释放进入细胞核之前。实验表明，在HSV-1感染细胞中有衣壳蛋白与核孔蛋白CAN / Nup214相互作用的证据，而沉默CAN/ Nup214后，可延迟病毒基因组在细胞核内复制的起始。实验还表明，UL25与CAN/ Nup214和hCG1相互作用，并结合UL36和pUL6。这两者分别是疱疹病毒颗粒组分中感染起始和病毒基因组释放的重要蛋白。尽管这些结果确定CAN/ Nup214可作为疱疹病毒衣壳体的核受体，但是其配体尚不清楚，而UL25可能只是提供了衣壳体蛋白和核受体蛋白的场所，随后病毒DNA释放到细胞核的过程也不明确。
还有实验认为，病毒基因组的释放并不需要其衣壳体降解，而是在通过衣壳体上的出口后，以双股单链DNA的形式进入细胞核。衣壳体不进入细胞核，似乎也不再发挥其他生物学功能。这个过程主要是UL6在发挥作用。但是，事实上，进入细胞核的病毒基因组，根本无法独自直接开始其复制过程，而是先由VP16参与转录激活后才能开始复制。这说明皮层蛋白进入细胞核是通过不同的途径进入细胞核的，尽管目前还没有基因组和皮层蛋白进入细胞核的直接证据。
目前，有关基因组进入细胞核研究最多的当属HIV。虽然HIV是逆转录RNA病毒，但是在其复制过程会产生dsDNA，其衣壳体外也有囊膜包裹，因此对疱疹病毒的基因组进入细胞核研究具有很好的启示作用。当然，这仅仅是研究的一个切入点。现有的HSV-1脱衣壳步骤如下：（1）入侵细胞的衣壳体定位至核孔复合物（NPC）；（2）NPC的开放以及高压力病毒基因组释放；（3）病毒基因组通过NPC转位至细胞核 (19)。最近有研究表明，MxB可以与HIV衣壳体结合，阻止HIV脱衣壳，从而抑制HIV的复制 。那么，MxB是否抑制HSV-1脱衣壳是值得研究的问题。
由于脱衣壳过程与病毒的核衣壳结构密切相关，也会让我们想到古代成语——金蝉脱壳。下面我们简要介绍一下衣壳体的结构。
衣壳体均由162个壳微粒组成一个二十面体的立体对称结构，其中有150个是六聚体，12个是五聚体。这些壳微粒具有疱疹病毒的特征性结构，即每个壳微粒的纵切面中间均有一直径4nm、长15nm的孔道。在五聚体和六聚体亚单位中，存在一种主要的衣壳蛋白VP5（UL19基因编码），以及两种次要的衣壳蛋白VP19c（UL38基因编码）和VP23（UL18基因编码）。两种次要的衣壳蛋白形成三联体结构，通常含有一个VP19c和两个VP23。另外，还有一种次要的衣壳蛋白VP26，位于六聚体的外缘。由这些结构蛋白组成的五聚体和六聚体亚单位装配成为病毒核衣壳之间，需要一个内部的支架蛋白pre-rp22a(由UL26.5基因编码)，这一蛋白与核衣壳体主要的结构蛋白的相互作用，决定了完整的核衣壳体趋向成熟。核衣壳体的成熟过程，咱们后面会说到。【参见绿皮书】
密度梯度离心实验发现，在HSV感染细胞的过程中，常可见三种形式的HSV核衣壳，即A、B、C三型。A型核衣壳是空衣壳，其中无DNA，也无DNA结合蛋白；B型核衣壳有DNA结合蛋白，少有或没有DNA；C型核衣壳有DNA，但少有或没有DNA结合蛋白。对这些不同形式的核衣壳的分析表明，C型核衣壳因含有完整的病毒DNA，可以发育为具有感染力的病毒颗粒；B型核衣壳则能够进一步装载DNA而转化成C型核衣壳；A型核衣壳则可能因为缺乏DNA结合蛋白而始终以空衣壳的形式存在。关于核衣壳，我们能够说的就这么多了，但是核衣壳在病毒从细胞膜移向细胞核的过程中的作用还有待于进一步研究，比如多功能蛋白UL13和Us3的作用等等。
金蝉脱壳
原文：存其形，完其势①；友不疑，敌不动。巽而止蛊②。
注释：①存其形，完其势，保存阵地已有的战斗形貌，进一步完备继续战斗的各种态势。②巽而止蛊：语出《易经•蛊》卦。艮在上卦，为静；巽为下卦，为谦逊，故说“谦虚沉静”，“弘大通泰”是天下大治之象。
译文：保存阵地的原形，造成还在原地防守的气势，使友军不怀疑，敌人也不敢贸然进犯。在敌人迷惑不解时，隐蔽地转移主力。）
第四章 心有所属
好了，我们已经走了一段路了。那么，咱们前面说的屌丝（病毒）爱上女白领（宿主细胞）也应该有下文了。咱们上次说到屌丝撞到女白领，一见钟情并以身相许。在屌丝的狂轰滥炸之下，女白领终于投降。今天是他们大喜的日子。他们结婚了。病毒千辛万苦的努力之后，也终于到了最为关键的时刻——洞房花烛。
在这里，我还要诚实的告诉大家，到目前为止，病毒基因组复制的具体机制并不清楚。现有的研究主要是与基因复制、转录表达和各种特定功能所需修饰相关的核内组合体——ND10（nuclear domain）。
ND10在形态上曾被叫做核小体，也称作早幼粒白细胞白血病蛋白体（PML）,它在核内以直径0.2~1um的核状结构存在，数量范围约为5~30个。有实验表明，HSV-1病毒在感染细胞时，其基因组DNA常常附着于PML小体上。而且，DNA的复制过程亦与PML小体具有拓扑学上的相关关系。同时，其他病毒，包括HCMV和腺病毒、SV40等也具有基因组DNA附着于PML的特性。这些现象似乎提示，当病毒移至细胞核膜，将其基因组DNA经核孔注入细胞核内后，病毒基因组DNA分子能够以PML小体为靶部位。而且，实验已证实，仅仅是那些能够最终形成完整增殖性感染的病毒，才会出现其基因组DNA靶向移动至PML并停留于此。这似乎意味着，病毒基因组DNA停留于PML小体，是因为病毒DNA需要PML小体的相关组成成分为其提供一个高效率转录的活性部位。有关HSV-1的研究表明，HSV-1基因组DNA定位于PML的基本前提是病毒的复制转录起始子Oris、具有转录调控活性的ICP0和ICP27蛋白以及PML小体的组分之一Daxx。【参见绿皮书】
另外，PML还参与疱疹病毒基因DNA的复制过程，但具体机制尚在进一步研究中。其中，研究较多的是病毒蛋白ICP0对PML小体降解作用。有实验发现，当HSV-1感染细胞时，常常会出现PML小体被破坏的现象。ICP0可同时与泛素相关蛋白酶体和PML小体结合而破坏PML小体，随后，其组分常在病毒基因组复制区域继续聚集，这些现象提示病毒基因的复制需要PML小体的相关成分。但具体是哪一成分，则至今都没有明确的回答。但是，又有实验发现。PML小体的破坏与否似乎并非是病毒DNA复制的绝对条件，因为ICP0缺失病毒仍然能够在细胞中正常进行DNA的复制，PML小体依然可以识别病毒基因组DNA复制的区域。基于这样的观察，有人认为，PML小体对病毒基因DNA复制的进行具有特殊意义，但不是绝对必需的。
更深入的研究提示，HSV-1的复制的确需要PML小体，因为HSV-1基因中形成复制的区域仍然是其基因与PML小体的相关结构。而这一区域缺失包括了ICP0和PML小体的相关结构。另外，只有在这一结构中，HSV-1基因DNA的复制才是最有效率的。同时，功能分析也提示，被疱疹病毒相关蛋白破坏的PML小体成分，常可以通过抑制依赖于PML小体的抗病毒反应而加强病毒的复制。
下面我们简要总结一下病毒基因组DNA入核后的一系列反应。病毒基因组入核后，基因组DNA靶向定位于PML小体。事实上，PML小体具有抗病毒作用，然而病毒的皮层蛋白ICP0具有E3泛素酶作用，可以破坏PML的结构，释放出病毒可以用于复制的细胞因子（不清楚具体因子是什么）。实验证明，感染细胞的病毒线性DNA很快形成环状的复制中间体。随后，病毒有可能同时以δ复制和θ复制的方式开始DNA复制过程（具体的复制过程咱们后面会说），从而完成病毒基因组DNA的复制。
第五章：始于足下（VP16的转录启动作用）
说实话，从VP16启动病毒基因组并开始表达蛋白到病毒颗粒包装完成直至释放才是病毒学的核心内容，因为我们在前面讲到的所有的病毒蛋白都是在转录启动的条件下产生的。
当疱疹病毒进入宿主细胞后，在一系列分子生物学事件的支持下，其基因组DNA将穿过核膜进入细胞核，这一过程依赖于病毒核衣壳的特定蛋白分子与细胞内某些分子，如微管蛋白的相互作用（咱们前面已经加以讨论）。当病毒基因DNA分子进入细胞核后，将出现一个由宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ复合体介导，并由病毒皮层蛋白VP16启动的转录启动事件。这一事件涉一些胞内蛋白分子，如Oct-1、HCF等，这些细胞蛋白与病毒蛋白形成的聚合体多蛋白复合物，将结合至疱疹病毒基因组中α基因的启动子区域，以顺式激活的方式启动5个α基因产物（以HSV-1为例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的转录，从而启动病毒基因组线性转录过程。随后，β基因产物开始产生（病毒DNA复制相关酶均为β基因产物），病毒基因DNA分子也开始复制。当γ基因产物（多为结构蛋白）也顺序被转录并翻译形成后，复制完整的基因即可作为子代病毒的基因组用于新病毒的装配合成了。
现有资料证明，在HSV病毒进入细胞后，使α基因转录启动的主要病毒功能蛋白就是VP16。VP16对HSVα基因的转录激活，主要针对几个病毒即刻早期基因，即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的编码基因5’端非编码区中的一个特定序列——TAATGARAT（R为任何嘌呤碱基核苷酸）起作用。但是，在DNA结合实验中，VP16并未显示出与任何DNA序列结合的能力，而对真核基因的转录调控的认识已经清楚地表明，转录调控因子与DNA特定功能基序的结合，是发挥转录激活或抑制作用发的结构前提。因此，既然VP16也具有转录激活功能，则其必定有相应的辅助因子。实验证明，VP16对特定DNA序列TAATGARAT的特异作用是基于其与胞内转录蛋白Oct-1的相互作用而实现的。但实验表明，在只有这两个成分存在的情况下，VP16与Oct-1的结合作用非常弱，并不能形成稳定的复合结构，除非有第三个蛋白——同属于胞内的调控蛋白——HCF的存在。但有意思的是，HCF既不与TAATGARAT结合，也不是从结构上连接VP16和Oct-1、它的存在意义在于诱导VP16出现一个构象的变化，使得VP16呈现一个新的空间结构而以较高的亲和力与Oct-1以及TAATGARAT序列立体结合。HCF激活VP16以形成一个包括HCF、VP16和Oct-1的复合体，特异识别并结合TAATGARAT序列的机理和过程不清楚，但的确是VP16产生HSVα基因转录激活的基本前提。因此，在某种意义上，我们可以认为，HCF的存在及功能对于VP16功能的发挥具有决定性意义。一些尚未肯定的实验表明，在缺乏Oct-1的情况下，如Oct-1基因缺失的细胞中，VP16和HCF的结合也依然可以诱导HSVα基因的基础表达。但在HCF缺乏的情况下，则VP16的转录激活功能将完全丧失。
早期的研究对Oct-1作为转录因子对特定序列TAATGARAT的结合在VP16转录激活过程中的作用也有过详细的分析。从现有资料看，由Oct-1介导的VP16的转录激活机制应该是HSVα基因转录表达的主流机制。对Oct-1及其他家族成员的细胞生物学结构分析表明，这个具有特定保守序列的蛋白有两个结合DNA的亚结构域，即POUs和POUn，前者指能与特定（specific）DNA序列结合的结构域，而后者为能与同源DNA序列（homeo-）结合的结构域。进一步的生物化学分析表明，VP16和Oct-1结合的特定部位在POUn区域中，而对于VP16来说，其与Oct-1结合的区域也在VP16-Oct-1-HCF复合体结合DNA靠近α基因启动子的部位。另外，VP16中的GARAT基序在该序列与Oct-1结合的过程中能够诱导POU结构域的构象变化而引导Oct-1-VP16-HCF复合体的形成，而后者直接导致了VP16对α基因启动子序列的识别。
作为皮层蛋白，当HSV-1进入细胞后，VP16即可以病毒的结构成分而发挥作用。有实验表明，当以重组病毒方式将VP16和GFP融合表达时，可以在病毒感染细胞后见到VP16主要聚集在细胞核与病毒复制相关的区域，但同时可在细胞质内存在，而且先是呈弥散状，在聚集到类囊状结构细胞器中，如高尔基体。同时，作为结构蛋白，VP16需要在病毒组装时进入子代病毒的颗粒中，毕竟HSV-1的皮层蛋白组分约占病毒核衣壳体积的50%。另外，有实验明确提示，VP16分子上的特定区域可以与RNA聚合酶Ⅱ复合物中的亚基TFⅡB发生相互作用，而这一作用与VP16的转录激活功能直接相关。还有实验表明，VP16可以与TBP、SAGA组氨酸乙酰化酶复合物发生相互作用，是以综合多重作用蛋白质的方式发挥功能的。目前，大家公认，VP16通过和Oct-1及HCF的结合只是其主要的作用方式，而与其他蛋白的相互作用，则形成其转录激活功能的调控机制。【参见绿皮书】
我们必须说明，VP16只能发挥转录激活，而不具备DNA结合作用，所以有人就提出一个问题，HSV在进化过程中，为什么没有进化产生一个既含有转录激活结构域，又含有特异性DNA结合结构域的VP16呢？这样的蛋白不是具有更高的转录效率吗？为什么必须依靠于两个宿主细胞的转录调控因子的特异结合呢？这个问题还要进一步的验证，但很可能是病毒的一种生存策略。当然，由于VP16是一种多功能蛋白，我们的探索还将继续。
信号通路实验发现，VP16可参与逃逸宿主的天然免疫作用。双荧光报告实验显示，VP16能够显著抑制IFN-β和NF-kB信号通路。那么，VP16是如何发挥抑制作用的呢？接下来，用VP16分别与信号通路的接头蛋白质粒共转染，检测其荧光强度的变化，发现VP16在IRF-3（使其二聚化）而不是IRF-7水平抑制IFN-β的表达；随后，在HSV-1感染条件下，采用Co-IP实验检测到VP16和IRF3相互作用。当然，VP16的其他功能，还有待于进一步研究。
第六章：即刻早期蛋白
接下来，咱们先来介绍一下VP16转录激活后诱导表达的第一个即可早期蛋白——ICP0。说起这个蛋白，我忽然想到“多才多艺”这个词，为什么呢？因为ICP0是一个多功能蛋白。多才多艺常用于形容才子，比如江南四大才子，唐伯虎、祝枝山、文征明和徐祯卿。他们个个琴棋书画，无所不知，无所不晓，博古通今，多才多艺。我们如果要给疱疹病毒学评选四个才子的话， ICP0一定榜上有名，而且是“四大才子”之首，相当于唐伯虎。
不过，作为一种病毒蛋白，ICP0可没有唐伯虎那种花前花后、酒醉酒醒的生活，它只记得它的使命——转录调控。现有的资料表明，ICP0是一个能在病毒感染过程中表现多种不同功能的病毒蛋白，它不仅可与某些病毒蛋白发生相互作用并与病毒早期基因和晚期基因的转录，同时，它还可对某些细胞内的基因转录产生影响。因此，有报道认为，ICP0是一种具有普遍意义的转录激活蛋白。
对ICP0在病毒感染过程中的动力学分析表明，新合成的ICP0分子通常出现在细胞核内或核结构附近的位置，这些位置相对应的结构点就是ND10。其主要组成成分即为早幼粒细胞白血病蛋白体（PML），而PML又可结合其他在染色体构象调控（如组蛋白乙酰化、去乙酰化）中起作用的蛋白，如Daxx、CBP、sp100等。这些蛋白在与PML结合的过程中可以呈现天然构象或是小分子泛素化修饰的状态。很明显，ICP0在这些部位的聚集及与相关分子的相互作用，提示其可能影响细胞内某些与染色体基因转录相关的调控因子。随着感染细胞内ICP0量的增加，其可逐渐在细胞核内弥散并充满整个细胞核。感染后期，尤其是病毒基因组DNA合成已经完毕后，该蛋白则可在细胞质内检出，这一现象事实上是ICP0通过某种尚未确定的机制（可能是与细胞周期蛋白D3）由细胞核移至细胞质导致的。还有报道认为，ICP0从细胞核移向细胞质的扩散过程中，同时促进了ND10结构的解聚及其组分，如PML、sp100等的降解。但这两个事件是否有因果关系尚需进一步确认。还有实验提示，ICP0和细胞内染色质组蛋白的乙酰化体系成分，如PCAF、CBP（二者也存在于PML聚集体中）之间有相互作用。而且，瞬时转染系统的分析表明，这样的结合可以细胞内乙酰化系统HAT的功能，并通过这一功能的改变而对病毒基因和细胞内某些基因进行调控，当然，这一初步结果尚需证实。
对ICP0功能的综合分析还进一步提示，ICP0可能作为一种泛素连接酶而参与了细胞内泛素-蛋白酶途径，具体表现为，首先是ICP0的C端结构（594-646位区）可以特异性地与USP7，即疱疹病毒自身编码的泛素特异性蛋白酶相互作用；其次，ICP0可以促进几种细胞蛋白的降解，并能诱导偶联泛素在其定位基础上的聚集，而且这一作用，正是由ICP0分子中的环指结构所决定的；最后，ICP0还能以一种特定的动力学方式，在感染细胞中和26S蛋白酶体产生相互作用，在蛋白酶体抑制剂存在时，ICP0即可稳定地结合在该蛋白酶体之上。我们知道，ICP0的环指结构具有明确的E3泛素连接酶的功能，而且，当其在感染细胞中和26S蛋白酶体结合时，又不被该蛋白酶体所降解。因而，从理论上讲，ICP0应该是病毒在感染细胞中为控制细胞的泛素系统而编码的组分之一，如果这个可能性的确存在的话，那么，病毒的这一设置，显然是基于其本身的增殖策略而具有针对性的。前面谈到，ICP0在感染细胞内可以引起PML、sp100等蛋白的降解，进一步的分析也证实，ICP0可能通过不同的方式，包括需要病毒蛋白编码的USP7的参与，利用泛素-蛋白酶体途径，降解PML、cdc34和sp100。而在这个过程中，ICP0的环指结构发挥了重要的泛素连接酶作用。
那么，作为HSV-1的一个即刻早期蛋白，ICP0为何要以如此复杂的方式参与这些细胞蛋白的降解，这样一个特定细胞蛋白降解的生物学事件，对病毒增殖的意义何在？有实验认为，尽管ICP0在其从细胞核移至细胞质的过程中引发PML的降解，但这一事件还有病毒蛋白UL13和Us3的参与。不过，PML的降解并不是病毒感染时其基因表达的重要基础，可能和α基因表达之后的其他病毒基因表达有关。
当然，我们知道PML、sp100作为ND10结构中的重要组分，与细胞染色体组蛋白去乙酰化过程相关，既然如此，那么ICP0降解这些与去乙酰化功能相关的蛋白质是否是为了增强或利用细胞内与此相对应的乙酰化转移酶（HAT）系统呢？因为细胞分子生物学研究已明确，乙酰化对于相当数量的基因转录调控具有重要的意义。尽管这些实验还需要进一步深入的证实，但其确实提示了ICP0在病毒基因调控中发挥的特殊功能。
进一步的实验提示，ICP0环指结构的破坏所引起的最明显而直接的结果就是ND10结构能保持完整，而其中的几个蛋白，如前面所提到的sp100、PML等也会继续保持其稳定状态。而这一稳定的结果，尤其是PML蛋白的稳定则可使细胞对在感染过程中产生的干扰素的敏感性的降低，这实际上增加了病毒对机体天然免疫系统的抗病毒反应的抵抗力（似乎矛盾，ICP0破坏降低了干扰素的敏感性？）。但是，这种抵抗力的增强和病毒基因或细胞基因的转录激活功能有何联系，仍然不得而知。另外，还有报道认为，由于ND10在ICP0的作用下破坏，使得该结构内的转录因子得以释放，从而加强了病毒基因和细胞基因的转录激活作用。不过，ICP0的转录激活作用对那些以转染或感染方式引入细胞的基因并无明显作用，这提示细胞中并不存在由于ICP0破坏ND10结构而释出的转录因子。而其他的一些研究认为，ICP0的真正效应可能是类似于组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，可增强组蛋白的乙酰化，从而加速基因的转录激活作用。这是个有意思的问题，但要证实这一点，则必须首先确定以感染或转染方式引入细胞的病毒基因DNA或其他DNA，是否在进入细胞后立即细胞组蛋白所结合，并使这些DNA形成特定的染色体结构，因为只有这样一个前提的存在，ICP0发挥促进相关蛋白乙酰化的作用才具有生物学意义。而且，有资料表明，在缺少ICP0时，只要有其他一些病毒蛋白存在，在细胞中所引起的病毒特定基因的沉寂也可以被克服。例如，在ICP0基因缺失的情况下，以高感染复数——即以高水平的VP16也可以保证病毒基因的完整表达，此时，能够代替ICP0作用的病毒蛋白是ICP8，这是一个在感染过程中极早期表达的、具有DNA结合能力的蛋白。因此，有关ICP0的这一可能特性，还需进一步的研究。【参见绿皮书】
此外，还有资料表明，ICP0能够与干扰素调节蛋白家族中的成员IRF3和IRF7产生相互作用，而这一通过ICP0环指结构域结合的作用是抑制这两个干扰素调节蛋白介导的干扰素刺激基因（ISG）的激活。我们知道，干扰素通过刺激细胞产生多种功能分子，是抗病毒效应的直接直接执行者。这些相关基因的激活抑制，显然可以影响或降低干扰素的抗病毒功能，而ICP0的这种作用，显然是HSV在宿主细胞增殖的重要支持。此外，也有实验发现，ICP0可以和细胞翻译系统中的延伸因子18发生相互作用，而此作用可以改变在体外系统中病毒mRNA的翻译效率，这一结果在HSV感染细胞内得到了证实。
总的来说，尽管ICP0被认为是一种病毒基因与细胞基因的转录激活子，但具有多种活性，能与多种病毒蛋白、细胞蛋白结合。所以，关于ICP0的功能还需要进一步研究。
接下来，咱们介绍一下ICP4、ICP27和ICP47。这里，咱们要说明的是，即刻早期蛋白的主要作用是转录调控β基因的表达，同时影响宿主细胞蛋白的表达。
在这5个即刻早期蛋白分子中，ICP4被初步确认为一种针对不同基因具有不同转录调控功能的分子，对于某些HSV本身的早期基因和晚期基因的转录激活过程，ICP4是重要的参与因素。因此，它对病毒感染过程中病毒的生长增殖是必须的。有资料表明，在瞬时转染实验中，ICP4的存在的确能激活多种基因，包括病毒基因和某些细胞基因。某些体外实验还表明，ICP4还能够增加其核系统环境中转录起始复合物形成的比例，这是通过促进转录起始复合物的成分中TFⅡD与DNA序列上TATA元件的结合而完成的。当然，ICP4分子内也有DNA结合区域，但在病毒早期或晚期启动子中针对ICP4的特异基序至今尚未最终确定。
另外，有实验表明，由于即刻早期蛋白（如α-0与α-4）启动子与早期及晚期蛋白启动子中TATA元件前后的序列有所不同，因此ICP4对α-0与α-4基因的转录激活呈现抑制作用。但也有实验认为，这是由于ICP4与转录起始复合物的成分TFⅡB相结合而导致的。尽管这些资料均未得到统一的结论，但是ICP4作为一种α基因的产物，表现出对早期和晚期基因的转录激活和对α基因的转录抑制，本身就提示α基因产物对β基因和γ基因转录的调控作用。【参见绿皮书】目前，关于ICP4转录激活早期和晚期基因的机制尚未完全解释清楚。
从结构上看，ICP4具有几个功能结构域，其中包括DNA结合区域，核定位区域和转录激活区域（TAD）。因此，ICP4在发挥其转录激活作用时，可以和DNA分子、TBP和TFⅡD形成复合物。实验表明，ICP4与TFⅡD结合的基础是ICP4与TBP相关因子（TAF）的结合。当然，这个复合物是针对病毒启动子的TATA元件。有实验对其与其他细胞分子形成复合物而结合于病毒基因启动子的分析表明，它需要结合并依赖多种细胞因子才能发挥其病毒基因转录激活效应。
HSV的另一个即刻早期蛋白ICP27，也对病毒早期基因和晚期基因的转录启动有重要的意义。但是，与ICP0（降解PML以释放转录成分）和ICP4（双重转录调控）不同，ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的转录本（mRNA水平）在感染细胞中聚集以保证病毒的复制，而将其基因敲除后的突变病毒将无法在感染细胞中实现正常的生长增殖。
ICP27也是一个多功能蛋白，而其功能实现则是通过它与多种细胞内蛋白质分子的相互作用。例如，ICP27通过与细胞内的RNA聚合酶Ⅱ全酶相互作用而实现对早期基因和晚期基因的转录启动。而同时，ICP27又能与细胞内RNA剪接体相关蛋白发生相互作用。实验表明，ICP27可与pre-mRNA剪接体相关蛋白P145（SAP145）相互作用，这一作用的直接结果就是细胞内相关的pre-mRNA剪接效率受到抑制。除此之外，ICP27还能与另一个剪接相关蛋白P32相互作用。P32是一个可以通过抑制ASF/SF2剪接体与RNA的结合和磷酸化而调节RNA的剪接，它与ICP27相互作用可以影响这一调节。有实验表明，ICP27可以引起细胞质内未剪接的细胞mRNA聚集，这一现象很可能与上述其与细胞RNA剪接系统的相互作用相关。结合ICP27对病毒早期基因和晚期基因转录的促进作用，这些资料显然提示ICP27在发挥自身对病毒的功能之外，还同时通过与细胞相应的蛋白相互作用而影响细胞RNA剪接来完成对病毒增殖的支持。
另外，还有实验表明，ICP27还能与细胞内的CK2和异源性核糖核蛋白K（hnRNPK）发生相互作用。我们知道，CK2是一种多效、非特异性的蛋白激酶，在HSV感染早期，ICP27即可刺激CK2从核内分布到细胞质，同时，CK2也能在受到ICP27刺激后使ICP27磷酸化。更为重要的是，此时的CK2还能使hnRNPK发生非正常的磷酸化，使hnRNPK的活性发生改变。而事实上，hnRNPK本身也是一个多功能蛋白，它可以在细胞核与细胞质之间来回转运，其可能的功能是进行pre-mRNA转运相关的活动。ICP27直接和通过CK2对pre-mRNA的影响，显然会对细胞本身的剪接系统产生相应的影响。有意思的是，实验还表明，ICP27还能与细胞的另一转运因子Aly/REF相互作用，并借此从细胞内的剪接体募集Aly/REF，以用于将病毒的一些无内含子的RNA转运出细胞核。同时，也有实验表明，ICP27还能与TAP/NXF1相互作用，这个蛋白也是将细胞内mRNA转运出细胞核的受体蛋白。这些作用之间的相互关系是一种什么样的机制至今尚不清楚，但是讨论至少提示ICP27是以一种多重方式为病毒在感染细胞过程中的复制战略的某一层面——mRNA处理层面——提供系统支持。此外，还有实验表明，ICP27也可能以特定的机制发挥激活NF-kB信号途径的作用。虽然这一功能还不清楚，但以NF-kB复杂的生理效应，如果这一观察被证实的话，显然还有更多的可能性会由此产生。
至于HSV的另一即刻早期蛋白ICP47，则具备完全不同的功能——ICP47是调节MHCⅠ类分子表达的重要病毒蛋白。研究表明，HSV编码的ICP47蛋白是一个位于细胞质的分子，它能阻断细胞内的MHCⅠ类分子在内质网及其他细胞器间的转运和成熟。该事情提示，ICP47蛋白对MHCⅠ类分子的可能靶点在其产生后开始组装为复合物的阶段。目前的机制认为，ICP47的作用靶点为TAP1/TAP2复合物。免疫沉淀和免疫荧光技术首先证明ICP47和TAP1/TAP2复合物的相互作用以及细胞内的共定位，并进一步证实在与ICP47结合后，TAP1/TAP2复合物失去了装运蛋白多肽以及结合MHCⅠ类分子的能力。其结果不仅使MHCⅠ类分子结合及呈递抗原多肽的途径受到阻碍，同时还能使未与抗原多头结合的空MHCⅠ类分子迅速降解。在此过程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能诱导的免疫反应效率明显受到影响。尽管从系统的角度可以设想，ICP47的作用不可能阻断所有关于HSV抗原的呈递，同时，ICP47在病毒感染过程中产生的时间亦决定了其不可能作用于HSV感染时免疫反应的全过程。但是，这一作用至少可以为HSV感染赢得一定的时间，使其免受免疫系统的攻击，这作为HSV调控免疫细胞而保护自身生存的策略之一，显然具有相应的意义。【参见绿皮书】
最后，咱们再稍微总结这些蛋白的功能并做些合理性地解释。ICP0、ICP4和ICP22参与转录激活，调控早期基因和晚期基因的转录（转录水平）；ICP27主要在pre-mRNA水平上调控宿主蛋白和病毒蛋白的表达（翻译水平）；ICP47抑制抗原肽-MHCⅠ类分子的呈递，避免病毒入侵的细胞受到免疫系统的攻击。在病毒感染细胞早期，所有即刻早期蛋白的核心任务就是为病毒的生存和增殖创造条件，此刻，生存大于一切。
我们可以这样认为，病毒感染宿主细胞后，囊膜与细胞膜融合，病毒颗粒沿微管蛋白由细胞膜移向细胞核，与此同时，含有核定位序列的皮层蛋白VP16脱落并通过某种机制入核。VP16与HCF、Oct-1形成复合物，并识别并结合通过核孔进入细胞核的病毒基因组DNA即刻早期基因启动子区域。随后，5个即刻早期蛋白开始顺次表达并发挥相应的功能。（至于命名原则，个人认为是依据蛋白起始密码子相对于启动子0的相对位置，比如α0是从启动子0位开始，纯属虚构，仅供参考）。
ICP22之所以放在最后来说，是因为ICP22基因还能编码一个小一些的同源蛋白Us1.5。作为一种即刻早期蛋白，ICP22也是一个根据不同环境而表现不同功能的调控因子（转录水平）。有报道认为，ICP22可以通过增强细胞周期蛋白cdc2以来的激酶活性而使细胞周期A和细胞周期蛋白B的降解减少而促进HSV晚期蛋白（γ2）的表达，这似乎是一种正调控作用。而且，ICP22被Us13磷酸化后，还可以促进晚期蛋白UL38, UL41, and Us11的表达。但也有实验表明，在瞬时转染系统中，ICP22可以表现出对多种启动子结构，包括HSV的α、β、γ基因启动子和某些细胞启动子的转录抑制作用，似乎与该蛋白和启动子中的共同元件TATA基序的作用有关。但是，ICP22的抑制作用在VP16的存在下可能被解除，因此提示ICP22可能与VP16一道，共同形成了病毒感染时对病毒α基因转录激活的正负调控机制。当然，有关这一机制的详细机理尚待进一步的探索。
事实上，作为即刻早期蛋白，ICP22的关注远不如其他成员如ICP0、ICP27等。下面，结合近年的几篇文献，我们可以更深入的了解ICP22的转录调控作用。
Bernard等发现ICP22可以与细胞周期蛋白cdc9相互作用并进一步调控晚期蛋白的表达。实验表明cdc9能够介导转录修饰后的ICP22与RNA Pol Ⅱ 相结合，并使其在转录复合体水平影响病毒蛋白的转录。不过，ICP22发挥这种功能的前提条件就是ICP22要被UL13磷酸化。但是，我们不得不考虑的是，UL13是一种晚期蛋白，所以这种调控极有可能是在病毒周期晚期发挥作用。Lei Guo等人的实验证实，ICP22和VP16都可以直接与转录延伸因子P-TEFb结合并在细胞内形成复合物。P-TEFb通过丝氨酸位的磷酸化RNA Pol Ⅱ以调节其转录延伸活性，从而调控mRNA的表达。这似乎进一步验证VP16和ICP22通过P-TEFb在转录水平对α、β和γ基因的表达形成正负调控机制。当然，这也为HSV-1感染细胞后基因表达的调控机制的探究提供更多证据。ThomasW. Bastian等从另一角度研究ICP22的功能。实验表明，ICP22可以与Hsc70共定位并诱导VICE（病毒诱导伴侣蛋白富集体，包括伴侣蛋白、蛋白酶体和泛素蛋白）的产生，从而促进病毒的复制。不过，与ICP0缺失病毒一样，ICP22缺失的病毒也可以在Vero细胞中生长。这似乎提示，ICP22可以通过其他细胞因子来调控病毒基因的表达。总的来说，ICP22也是一个参与病毒基因和宿主基因调控的多功能蛋白。它的主要作用机制似乎也是通过与宿主细胞因子相互作用，并通过多种机制发挥转录调控功能。但是，作为一种即刻早期蛋白，ICP22的作用的确需要我们更多的关注。
作为ICP22（亦即Us1）的同源蛋白，Us1.5的功能也受到人们的关注。Us1.5的启动子和编码区域均包含在α22中，而且大多数ICP22的功能也与Us1.5的开放读码框（ORF）相关。因此，咱们在这里不再具体介绍Us1.5的功能。
第七章：按部就班（复制、转录相关病毒蛋白）
朋友，谢谢你能读到这里。咱们已经走完一半的路程了。但是，革命尚未成功，我们仍需努力，因为接下来的任务更加艰巨。
我们知道，在病毒基因组DNA进入细胞核后，在VP16的转录起始作用下，5个α基因得以转录表达。随着转录事件发生及其线性程序的进行，25个早期蛋白（β基因）开始表达，其中最重要的早期蛋白（E蛋白）为复制相关蛋白，它们均由位于UL区域的基因编码，分别是：UL5、UL8、UL9、UL29、UL30、UL42、UL52。同时，一些已存在于病毒蛋白体内的蛋白分子也将按照固定程序发挥作用，使得病毒基因DNA的复制随之启动。客观地讲，这一时段是在病毒感染细胞2~3h时，其中有些步骤在病毒基因发生转录事件时就已同步进行。例如，某些蛋白分子在核内前复制位置的定位、与DNA分子的结合等。但是，严格地讲，这一过程还是在其所需的相关病毒蛋白已准备完毕的情况下，按照蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用所遵循的动力学规则顺序进行的。此过程中，HSV按照一种与许多其他人类病毒不同，而与某些细菌病毒相似的方式操作的，它存在两种模式，即θ复制和δ复制。这两种复制模式的结合，最大限度地利用了病毒基因结构的特点，使其能够以有限的空间和时间资源，尽可能有效地复制子代病毒。【参见绿皮书】
在详细介绍病毒复制之前，我们有必要先了解HSV-1基因组的基本结构。和其他疱疹病毒相同，HSV病毒基因结构为双股线性DNA，当然，在病毒颗粒中，这一DNA基因组是以环形或是轴线状被包裹在衣壳中的。此时，该DNA分子的末端常常是交叠在一起或是保持很近的距离，这种形状的机制显然是为了病毒颗粒在感染细胞时，一旦核衣壳结构破坏，HSV的DNA分子即可形成环状结构而经核孔进入细胞核，以便于转录和复制。HSV病毒DNA分为长片段UL (unique sequence of long component)和短片段Us (unique sequence of short component)。这两个片段为单一序列，其两侧为重复序列，而末端的重复序列（a序列）是高度保守的，它们仅出现内部重复序列数量上的变化。
实验表明，在病毒感染细胞半小时后，尽管细胞内还没有任何病毒蛋白，但病毒基因组DNA就已经可以在细胞核内检出，而此时在核内开始积累的病毒基因DNA所呈现的形式是一种无游离尾端的构型，这种构型的基因DNA随即形成环状结构。具体机制是HSV基因末端均具有a序列，该序列的直接重复结构在未知原理下形成尾-尾相互连接，使整个基因分子在进入细胞核内后经过一个短暂的过程，即形成环状的复制中间体。这种环状DNA形式存在的基本意义，很可能是为一种已知的θ复制机制提供结构基础，尽管这一点在HSV还未得到直接的最终证实。
目前，对HSV病毒基因组DNA结构的分析表明，DNA复制起始结构含有用于DNA复制的三个顺式作用元件，它们均可以作为DNA复制的起始点，分别为一个OriL和两个OriS，前者位于UL29和UL30基因之间，而后者位于内部重复短端（IRS）和尾部重复短端（TRS）的C序列中，大致是ICP4和ICP22/47基因之间的位置。该推断的实验证据是观察到DNA复制泡首先出现在相应位置，即UL区域和IRS/TRS部位，而对DNA复制的序列分析也能定位于此。另外的实验也表明，DNA复制最先合成的DNA序列亦是UL-Us结合部的序列。
对上述结构的进一步分析表明，OriS和OriL分别含有一个45bp和144bp的回文序列，中部有一个18~20bp富含A+T的区域，而此区域的侧翼是特定的重复序列，可由病毒UL9基因编码的DNA起始结合蛋白特定识别。在OriS结构中，一侧能与该蛋白产生高亲和性结合的区域BoxⅠ，而另一侧的BoxⅡ则只能以1/10的亲和力与这一蛋白结合。同时，OriL有2个BoxⅠ拷贝，而OriS只有1个。尽管BoxⅢ与BoxⅠ有很接近的结构，但仅以一个碱基的差异，就表现为与DNA起始结合蛋白的低亲和性。而相关的实验表明，OriS的有效复制起始作用需要两个DNA起始结合蛋白识别部位的完整结构，即BoxⅠ和BoxⅡ。这样一种结构以及OriS和OriL都作为DNA复制起始位点的机制尚不清楚，但根据对这两个起始部位的分析和现有的DNA复制模型，可以认为二者的存在都应该是符合其功能需要的。Loss-of-function实验表明，即使将两个OriS都去除，也不会完全影响病毒DNA的复制，这似乎提示，HSV基因DNA的复制有可能同时以θ复制和δ复制的方式进行，而且二者都可由OriS或OriL执行。所以，这两个起始点的结构并无明显的功能意义上的区别。
目前，关于HSV基因DNA复制的具体机制还没有完全解释清楚，但从许多不同的报道中，可以理出一个基本的模型和过程。简单地说，这个模式的中心环节就是，病毒基因组在借其特殊结构形成环状结构之后，其DNA分子复制过程的起始借助于一个可在λ噬菌体中可见的θ模式进行。随后DNA分子以滚环方式不断复制出子代的基因组DNA，其以串联体形式产生，再经酶解包装成单个的DNA分子，这一过程涉及了多个病毒基因自身编码的功能蛋白的相互作用。同时，病毒也可以利用宿主细胞的某些功能酶分子，如DNA聚合酶-引物酶来完成这一事件，但不依赖于这些宿主蛋白。下面我们根据现有的资料，大体介绍病毒的复制过程。
关于病毒DNA复制的模型，已经肯定的是，首先应该是UL9基因编码的蛋白（起始结合蛋白）结合到病毒DNA具有高亲和力识别的复制起始部位，即前面提到的BoxⅠ。随后，UL9形成同源二聚体并募集其他起始结合蛋白辅助分子结合到较低亲和力的识别部位，如BoxⅡ和BoxⅢ。随后，UL9（起始结合蛋白）通过其C端的DNA结合结构域进一步结合ICP8（UL29，单链DNA结合蛋白），后者可以刺激起始蛋白所具有的DNA解旋酶活性和ATP酶活性。这样，病毒DNA双链分子出现解旋状态，并形成单链构象以便于下一步DNA分子的复制。
随后，UL9通过其N端结构结合UL8、UL5的基因编码产物（均为DNA复制蛋白亚基），并由此将引物酶活性引入复制起始复合体，但该酶并不以OriS的基本结构作为模板，而是随着复合体对DNA起始部位双链的解旋，以起始部位旁侧的序列作为模板。有资料表明，起始结合蛋白亦能以同样的方式结合到人源细胞内的DNA聚合酶复合体中的α引物酶，并形成复制过程所需的起始引物以便复制链的延伸。这意味着HSV病毒基因的复制可以使用自身的引物酶，也能使用宿主细胞的α引物酶，这一策略显然是十分有用的。
在DNA双链解旋以及起始引物合成之后，UL9即完成了任务，并与DNA分子解离，而此时，未解旋的DNA区域仍由ICP8蛋白分子结合。随后，ICP8通过特定方式结合HSV本身的DNA聚合聚酶体——包括UL30、UL42、UL52基因编码的亚基部分——并促进聚合酶发挥作用。由UL30和UL42构成的二聚体可以催化前导链的合成，但后随链的合成则是由UL30单独地、总是低效率地完成的。
事实上，病毒基因组DNA在复制的同时，转录相关酶（部分β基因）也开始表达并发挥功能。转录调控是比复制过程更为复杂的细胞活动，具体机制也是扑朔迷离，公说公有理，婆说婆有理。但是，从病毒的角度看，一切的核心其实就是完成核衣壳蛋白的组装，并包裹病毒DNA以完成其复制周期。
按照中心法则以及生化知识，我们可以知道，病毒会在转录（包括转录后调控）、翻译以及翻译后修饰等各个水平影响调控自身蛋白的表达。咱们在前面介绍的ICP0（降解PML）、VP16（转录起始）、ICP27（pre-mRNA剪接）都是病毒调控蛋白表达的实例。我们可会发现，病毒蛋白表达的调控通常是与宿主细胞因子相互作用共同完成的。下面咱们结合UL41和γ34.5对宿主翻译系统的影响来具体谈谈病毒蛋白的调控功能。
和其他人类疱疹病毒一样，HSV感染宿主细胞过程中依次出现α基因、β基因和γ基因的转录表达，除了α基因（即刻早期蛋白）的表达，β基因和γ基因既编码病毒的结构蛋白，也编码用于病毒基因复制和细胞翻译系统的功能蛋白。其原因很简单，所有的病毒增殖所需的功能和结构蛋白都需要通过细胞的翻译系统而产生。事实上，在感染宿主细胞3h内，HSV可使宿主细胞蛋白的合成和mRNA水平下降90%。显然，随后的现象就是病毒的蛋白迅速上升呈主导地位。从分子生物角度讲，这一过程实际上是由病毒多种蛋白执行的多种机制所导致的，总体上可分为两个阶段。第一阶段是宿主细胞内原先存在的多聚核糖体迅速降解，以及一些细胞mRNA和病毒mRNA的迅速降解。这一过程发生迅速，通常在病毒感染的早期即可出现。而第二阶段则是宿主细胞蛋白合成体系在感染的过程出现关闭，其出现的前提是某些病毒基因已经得以表达。换句话说，HSV感染后导致细胞出现的宿主蛋白合成是以不同时段中由不同机制引起的。
应该说，HSV影响宿主细胞蛋白合成的详细机制至今还留有许多疑问。但是，初步的分析表明，在第一阶段宿主蛋白合成系统关闭的过程中，至少有一种病毒蛋白——病毒宿主关闭蛋白（VHS，virion hostshut-off,该蛋白由UL41基因编码）——发挥了作用。VHS可使mRNA去稳定，这在一定程度上导致了多聚核糖体的解离。我们知道，VHS是一种皮层蛋白，在病毒感染早期即可释放进入细胞质发挥作用。因此，其在感染的极早期发挥作用就是可以理解的了。但有关VHS降解mRNA的机制还不确定，只有一些实验供我们推到理解。首先，当将来自未感染细胞的多聚核糖体和自HSV感染细胞的细胞质上清共同孵育时，可以导致用于实验的稳定的mRNA分子迅速降解。其次，从HSV病毒毒粒制备的VHS蛋白粗体物或者是含有VHS的网状红细胞裂解液可以明显的增强RNA酶的活性，但若是使用VHS的突变体蛋白则对RNA酶无类似影响。最后，利用抗VHS抗体可以在非细胞系统中抑制VHS在上述情况下所表现的RNA酶增强功能。这些证据表明，VHS蛋白的确通过增强RNA酶活性而降解mRNA的功能。不过，当将纯化的VHS蛋白与mRNA分子共同孵育时，则未见VHS对mRNA分子的降解。这提示VHS还利用了另外未知的细胞因子介导其对RNA酶活性的增强。另外，还有实验表明，在HSV感染细胞中，具有多聚腺苷结构的mRNA分子比无多聚腺苷信号结构的mRNA表现出更快、更明显的降解作用。同时，去腺苷化的mRNA分子在HSV感染的细胞中可见明显的聚集。这似乎提示了VHS蛋白具有针对多聚腺苷信号序列的识别结构，但这样的结构在VHS中尚未确定。不过，进一步的研究则提示，VHS似乎是通过与PABP复合物的结合而定位于poly（A）的位置。综上所述，VHS确实可能通过细胞内核糖核蛋白（RNP）复合体中的某些特定因子而发挥作用，而且执行此功能是以自身和/或其他因子的协同作用并在一至数个关键位点，例如poly（A）的位置，切割降解mRNA分子。有趣的是，这个位置实际上是细胞mRNA分子为了逃避宿主RNA酶的降解而具有的结构。【参见绿皮书】目前研究认为，VHS是与eIF4B、eIF4H协同完成其降解功能的，eIF4F也发挥部分作用。但是其降解的mRNA序列的特列的研究尚无进展。
除了VHS的研究，另一焦点就是病毒蛋白γ34.5。（VHS在mRNA 水平，而γ34.5在翻译后修饰水平发挥作用）。通常在一些病毒感染的细胞中，病毒复制过程中产生的一些高度结构化的双链RNA（dsRNA）可以结合并激活宿主细胞内的PKR（蛋白激酶R），后者随之使eIF2α分子磷酸化，这导致的直接结果就是细胞的翻译系统丧失其功能活性。同时，病毒的蛋白合成及复制也将在感染细胞中受到抑制。有实验表明，在缺失γ34.5基因的HSV的感染中，这些病毒不能在人类的一些恶性肿瘤组织生长，而同时这些细胞表现出较高的PKR表达和活性，也可见到其eIF2α的磷酸化极为明显，使得病毒感染的细胞过早出现蛋白合成的关闭，而导致病毒的生长受到阻滞，而且这一过程不是由VHS的蛋白合成关闭功能和mRNA 降解引起的。
事实上，随后实验亦表明γ34.5基因编码产物确实以不同的作用模式参与上述事件。例如，酵母双杂交实验证明，γ34.5基因编码产物能够和细胞蛋白磷酸酶1α（PP1α）发生相互作用，进一步实验表明，它们可以形成复合物，而且含有这种复合物的组分可以使纯化的eIF2α分子发生去磷酸化作用。换句话说，γ34.5基因产物可以作为PP1α的调节子或是复合物的靶向性亚单位是其将eIF2α分子去磷酸化以中和PKR的活性。但此过程的具体机理还不清楚，因为还没有实验证实γ34.5基因产物和PP1α之间具有直接的相互作用。不过，有实验提示，PP1α可以直接结合eIF2α并使其磷酸化，但是这种现象是否能在HSV感染的细胞中出现还不清楚。同时，还有实验表明，病毒蛋白Us11编码产物能够补偿γ34.5的功能。Us11可以与RNA结合并与核糖体相关联，从而降低PKR的活性。
综合这些自资料，我们可以看到，HSV至少编码两种蛋白——Us1 和γ34.5，通过靶向结合细胞的PKR和eIF2α来影响调控细胞的翻译机器，而这两种蛋白的作用显然是相互协调和互补的。γ34.5基因产物中包含一个与细胞蛋白GADD34分子具有典型同源结构的区域，而GADD是细胞在受到一些终止生长、DNA损坏和特定分化信号刺激时所产生的一种蛋白质。而且，它可以和PP1α发生相互作用，并在γ34.5基因缺失的突变体病毒感染细胞中替代γ34.5基因产物的功能，以延长晚期蛋白合成。当然，其他病毒蛋白，尤其是皮层蛋白是否也在病毒转录、翻译等过程中发挥调控作用还需要进一步探索。
第八章 建筑高手（衣壳形成和DNA组装）
对于病毒来说，接下来的事情就顺理成章了——组装核衣壳体和装配DNA。前面咱们已经介绍核衣壳的组成和结构，下面咱们主要介绍核衣壳体的装配过程。
研究HSV-1感染的细胞中核衣壳体蛋白的相互作用并由此形成核衣壳体基本结构的过程是非常困难的，因为大量细胞蛋白和病毒蛋白的存在使许多敏感精细的技术无法确定这些结构蛋白之间的关系。目前，根据蛋白质相互作用的基本动力学原理，一种体外蛋白相互作用分析系统的技术得到了应用。
在此体系中，利用表达纯化的方法得到相关病毒蛋白以期认识它们之间的关系。该实验证实，VP23和VP19c具有明显的相互作用的特性，这种特性使得两个VP23趋于形成同源二聚体，而此同源二聚体又能够与一个VP19c分子形成异源三聚体。这个三聚体在结构上表现为类三角棱体，是HSV-1核衣壳微粒结构中的重要连接结构。利用突变分析表明，在此三联体结构中，VP19c的C端15个氨基酸与整个三联体的结构活性直接相关。去掉这15个氨基酸的VP19c仍然能够与VP23反应，但是该三联体将不能作为核衣壳体的结构单位实施功能。由此可以认为，VP19c的C端可能是与主要的衣壳蛋白VP5相互作用的部位。与此相反的是，VP19c的N端则与三联体的结构活性无关，当去除N端的90个氨基酸时，该三联体仍然形成最终的前壳体结构，但是当去除N端的105个氨基酸时，该三联体的结构活性明显丢失。这提示，在N端90-105位的氨基酸中存在一个与其他蛋白相互作用的结构域。对VP23的突变分析也表明，VP23的C端与三联体的结构活性直接相关，去除其C端10个氨基酸，即可使其结构活性丧失；而在去除N端71个氨基酸时，才可看到其对三联体结构活性的影响。
在研究三联体结构形成的同时，主要壳体蛋白VP5与折叠蛋白pre-VP22a的相互关系以及二者与三联体蛋白的关系也得以认识。体外蛋白装配体系和相关方法，如密度梯度离心等，均提示VP5可以先和pre-VP22a相互作用。这一相互作用依赖于VP5与pre-VP22aC端25 个氨基酸所形成特定结构的接触，从而形成一个VP5和pre22a复合体；而随着这个结合，pre-VP22a折叠结构舒展开来并以一个机理未知的动力学过程将上述25个氨基酸切下。此时，VP5和pre-VP22a形成的复合物将作为衣壳微粒的主要结构，但是，该复合物还需与VP19c-VP23三联体复合物结合，形成一个半弧状的结构体，通常称作核衣壳体部分结构单位（partial capsid），多个这样的结构进一步聚合形成核衣壳前体（procapsid）。之后，核衣壳前体结构中的pre-VP22a经病毒丝氨酸蛋白酶的酶解清除，则该核衣壳前体进一步成熟为核衣壳体。这一过程在病毒感染的细胞中基本得到了证实，而且，细胞内的荧光定位分析进一步确认，VP5与pre-VP22a的相互作用以及VP19c与VP23形成三联体的过程均发生于细胞质中。之后，两个复合物蛋白转移入细胞核，在核内聚集形成核衣壳部分结构单位和核衣壳前体。
事实上，在病毒核衣壳形成之后，病毒接下来的最重要事件就是基因DNA在特定的机制下装配进入核衣壳。在HSV-1病毒中，它至少涉及7个基因编码蛋白，分别由UL6、UL15、UL25、UL28、UL32、UL33以及UL17基因编码。此外，UL12基因编码的蛋白亦发挥一定的作用，尽管不是绝对必需的，但是这个蛋白的缺失可使病毒的产量降低100~1000倍。分子生物学的分析表明，UL12基因编码的蛋白属于碱性磷酸酶，虽然其不直接在病毒基因DNA的包装中发挥，但也（间接）参与了DNA的包装过程。
另外，其他几个蛋白均直接参与DNA的酶切与包装作用。例如，突变体实验表明，UL25编码蛋白的作用似乎是将病毒基因组DNA固定于核衣壳体内，其他几个蛋白则同时作为核衣壳体的结构成分，同时也作为DNA的包装功能发挥作用。但它们在不同形式的核衣壳体中的存在又有所不同，如UL6、UL17、UL15和UL25这4个基因编码蛋白都可以在A、B、C三种核衣壳形式以及成熟核衣壳体中存在。这似乎意味着它们在作为核衣壳结构成分的同时也发挥DNA包装及酶切的功能。更有意思的是，UL17基因编码产物对于病毒基因组DNA进入核衣壳前体是不可缺少的结构，因此，它也同时存在于三种形式的核衣壳以及成熟的病毒颗粒中。这些现象表明，它既是一种次要的核衣壳结构蛋白，也以病毒的皮层蛋白形式存在，而且它在成熟病毒颗粒中的数量大约是C型核衣壳形式中的两倍。UL6编码的蛋白也是一种次要的核衣壳蛋白，不过，它在DNA包装过程中可以形成核衣壳结构上的DNA入口（Portal）。从核衣壳的结构看，每一个形成的核衣壳均具有一个环指形式的入口。该入口位于核衣壳体的轴线上，是12个垂直面上的一个中心位置结构，由12个UL6基因编码蛋白组成。其组装过程的启动（initiation step）其实是在部分核衣壳体形成过程中开始的，并随着核衣壳前体的形成而组装进入核衣壳结构的特定位置。
第九章：完美绽放（病毒出核膜和释放）
核衣壳在细胞核内装配完成后，病毒首先要从细胞核逸出至细胞质。在这个过程中，它要穿过核膜并经历第一次外膜包裹。当到达细胞质后，病毒需要去除第一次包裹形成的外膜，并完成皮层蛋白层化（tegumentation），使得核衣壳外形成一层皮层蛋白。然后，病毒再次穿越细胞质膜，并经历第二次外膜包裹而逸出细胞，从而形成最终的成熟病毒颗粒。病毒的装配与逸出过程是我们认识和理解病毒复制周期以及基因功能的重要环节。
当疱疹病毒经过转录、DNA复制以及DNA在核衣壳的组装而形成完整的核衣壳体后，该核衣壳体在细胞核膜的内膜上形成出芽状态。在这个出芽过程中，核衣壳体就可以获得来自于细胞核膜的内膜叶。这一过程在HSV-1感染细胞中已得到详细的分析，而且，其动态过程也得到了细致的资料。
实验表明，HSV-1核衣壳体在细胞内膜上出芽并获得第一次的囊膜而进入核周间隙中。事实上，这一过程不是简单的核衣壳体跨膜运动，有两个病毒蛋白，即UL31和UL34基因编码产物参与了该过程。进一步的实验表明，UL34蛋白是一个Ⅱ型囊膜锚定蛋白，在表达后存在于感染细胞的核膜间隙中；而UL31蛋白则是核磷酸化蛋白，位于感染细胞的核膜上。酵母双杂交实验和蛋白质结合实验表明二者具有物理意义上的相互结合，因此它们可能是以一种相互结合的形式决定它们在膜上的稳定性。突变分析表明，二者之中缺乏任何一个后，核衣壳体逸出核膜的过程都会失败。在HSV-1感染细胞中观察到，核衣壳体在逸出核膜过程中可导致该核膜相邻层状体的部分损坏。这很明显地提示，UL34蛋白可通过破坏核膜层状体结构而为病毒核衣壳体逸出细胞膜提供先决条件。病毒结构的分析表明，逸出核膜、经过第一次囊膜包裹的病毒毒粒表面确实存在UL31和UL34蛋白，但成熟的病毒颗粒上则不含有这两个蛋白分子。因此，有实验认为，UL34蛋白属于病毒核衣壳体第一次囊膜上的蛋白，而UL31蛋白则可能属于病毒成熟过程中第一次装配的皮层蛋白。从这个意义看，这两个蛋白确实可能在核衣壳体逸出核膜过程中以相互作用的方式参与这一过程。这一过程是否涉及其他膜蛋白或皮层蛋白尚不清楚，但可以肯定的是，成熟病毒颗粒囊膜表面存在的糖蛋白，如gB、gC等肯定不参与这一过程。
在上述过程结束后，随后的事件就有一些细节不太确定了。最近，免疫电镜实验证实，核周间隙的病毒颗粒与成熟病毒颗粒在结构上的差异主要表现为，核周间隙的病毒颗粒具有UL31和UL34蛋白，而存在于胞质或是胞外的病毒颗粒则已不具有这两种蛋白。但是，核周间隙的病毒颗粒所不具有的两个主要皮层蛋白（UL49和UL46基因编码）则明显存在于胞外或是胞质的病毒颗粒中。不过，尽管如此，在这一模型中，核周间隙与核外膜层状物融合的具体分子机制仍不清楚。【参见绿皮书】
事实上，病毒释放的过程也是极为复杂的，皮层蛋白和囊膜蛋白在其中都有什么样的作用呢？我们知道，跟许多其他DNA或RNA病毒明显不同的是，HSV-1等疱疹病毒具有相当数量的皮层蛋白。那么这些蛋白除了结构上的意义之外，是否还有非结构的功能呢？
最近的实验表明，这些皮层蛋白之所以被认为是执行基质蛋白的功能，是因为它们既可以与病毒的核衣壳体结构结合，又可与病毒囊膜的糖蛋白的内部尾端相结合，使得它们成为病毒颗粒完整结构的中间部分。尽管如此，长期以来，人们都倾向于把皮层蛋白看做是非结构蛋白。随着低温电镜分析的深入，人们发现至少在HSV-1的结构中，皮层蛋白靠近核衣壳体的最深层部位，也同样呈现出二十面体对称形状。而形成这样一个结构的原因，是由于一个最大的、约含2000个氨基酸的皮层蛋白——UL36基因编码蛋白——能够与核衣壳体直接作用而形成结合体。进一步的蛋白质分析表明，UL36蛋白确实可以与核衣壳蛋白UL19蛋白相互作用而结合，这使得围绕核衣壳体的第一层皮层蛋白（即UL36蛋白）在形状上呈现出二十面体的结构。在此基础上，如果在病毒中利用突变技术敲除另一皮层蛋白UL37基因，则病毒核衣壳体就会停留聚集于细胞质内而不会形成成熟颗粒。这些聚集的核衣壳体不会发生直接的相互作用，但是可以以突出的蛋白膜状结构相互接触。有学者认为，这种膜状物的结合，实际上就是由UL36蛋白介导的。在UL37基因突变的情况下，它们因为失去局部位置的限制而出现变构。由此推断，固定UL36蛋白以保持其特定二十面体结构的就是UL37蛋白。因此，可以认为，皮层蛋白的第二层就是UL37蛋白。有意思的是，UL36和UL37蛋白差不多在所有人类疱疹病毒中都具有明显的保守性。
但是，一些病毒形态学的初步分析似乎提示，某些皮层蛋白的缺失，好像并不具有特别重要的意义。例如，UL13、Us3、UL41、UL46、UL47、UL49基因的缺失似乎并不影响病毒成熟颗粒的形成。但是，当敲除UL48（即VP16）基因时，病毒颗粒在细胞质的成熟受到明显干扰，这表明VP16 是皮层蛋白层中的重要成分。进一步的分析表明，VP16可以和其他皮层蛋白，如UL49（VP22蛋白）相互作用。另外，还可以与UL41（VHS蛋白）相互作用，而此作用对病毒的发育成熟有明显的影响，因为对VHS基因缺失的突变分析表明，当VHS基因突变足以影响其与VP16的结合时，VHS就无法被装配进入HSV-1毒粒之中，而完整的病毒颗粒就难以形成。另外，VP16还能够和UL46、UL47编码的VP11/12、VP13/14以及糖蛋白具有相互作用。虽然这些作用的机理及直接结果尚不明确，但至少可以提示，VP16对病毒间质化的过程和布局具有十分重要的作用。这样一个在病毒结构和成熟装配中具有重要意义，又在病毒基因转录激活中具有重要作用的双层功能蛋白，确实具有很大的研究价值。根据现有资料，目前皮层蛋白包括，UL4、UL11、UL13、UL14、UL21、UL36、UL37、UL41、UL46、UL48、UL49、UL51、UL56、ICP0、ICP4、Us3、Us10、Us11。我们看到，这些蛋白均大多具有非结构功能，因此，我们可以推断，皮层蛋白的功能还很值得我们去探究。
但是，在整个释放过程中，囊膜蛋白才是真正的主角。根据现有资料，囊膜蛋白包括UL1、UL10、UL20、UL22、UL27、UL43、UL44、UL45、UL49.5、UL53、Us5、Us6、Us7、Us8和Us9等，这些蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中扮演重要的角色。接下来，我们介绍这些囊膜蛋白的形成。
在病毒完成间质化之后，其成熟过程的下一步就是第二次囊膜装配。从形态学上看，这次囊膜蛋白的装配是由处于细胞质的核衣壳体经过在细胞质中的囊泡膜上的芽生过程而形成一个完整的病毒颗粒。而后，包裹这个病毒颗粒的囊泡再与细胞质膜融合，将包含在其中的成熟病毒颗粒释放出细胞。
尽管形态学分析已经清晰地揭示HSV-1病毒成熟的第二次囊膜装配过程，但有关这一生物学事件的分子机理仍不清楚。不过，一些关于HSV-1病毒囊膜糖蛋白的突变分析提示，这次囊膜装配的过程似乎与这些囊膜糖蛋白相关。就一般的遗传学意义上看，位于囊膜的HSV-1编码糖蛋白对病毒的复制与增殖似乎无直接的必要联系，但当病毒缺失糖蛋白gE、gI和gM时，则病毒在敏感细胞中的噬斑形成将受到明显抑制。因此，gE、gI和gM对病毒的第二次囊膜装配具有非常重要的作用。而且，发挥这一作用的可能就是这些糖蛋白的尾部，因为有实验表明，当在上述突变体中的糖蛋白gD的跨膜区融合入gE的尾部时，则能够在一定程度上改变上述突变体的表型。此外，在在第二次囊膜装配的过程中，病毒囊膜糖蛋白在囊泡上的排列具有严格的方向性以确保糖蛋白的尾部均与间质化的核衣壳体结合。酵母双杂交实验确证，糖蛋白，如gE蛋白、gM蛋白的尾部与UL49蛋白有特异的相互作用。从这个意义上看，UL49蛋白也应该在病毒的第二次囊膜装配过程中具有重要的意义。但有意思的是，在一些疱疹病毒增殖及毒粒形成过程中，如UL49蛋白并非绝对需要。但在VZV中，该产物又是十分重要的；同时，HSV-1的gE和gI基因的缺失则会使细胞的装配受阻。从这些资料看，我们可以初步明确的是，细胞质内的核衣壳体与UL36蛋白之间的相互作用，以及UL49蛋白与gE、gI和gM之间的相互作用。
当然，也许其他未知蛋白之间的相互作用，是促进病毒第二次囊膜装配的主动原因。有实验观察很清楚地证明，在去除了UL37基因的病毒感染的细胞中，金标抗体检测证实UL49蛋白细胞质内的质膜上，而囊膜在聚集的核衣壳体内被发现。还有实验表明，gE蛋白，尤其是gE的膜内结构域与HSV-1在组织培养中的极性细胞和神经细胞之间的传递过程有明显关系。这可能是由于gE/gI复合物通常结合于细胞-细胞之间的结合部所致。当然，有推论认为，这可能是gE/gI引导间质化的核衣壳体通过特定囊泡膜部位形成出芽的原因。总的来说，在已间质化的核衣壳体进行第二次囊膜装配的过程中，还有许多未知的机理有待于了解。但是，大体过程我们是可以知道的。
第十章：病毒复制的整个周期
HSV在进入细胞的过程中，通过膜蛋白和多个细胞受体、辅助受体的结合以完成其介导病毒囊膜与细胞膜融合并使病毒进入细胞的任务。现有模型认为，HSV在吸附细胞膜表面时，先是糖蛋白gC和/或gB与细胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白（HSPG）非特异性结合，这种结合使得病毒囊膜与细胞膜的空间距离缩短。随后，gD与胞膜上的特异性受体结合，后者可能为HVEM（herpes virusentry mediator，肿瘤坏死因子家族成员），或是nectin-1和nectin2（免疫球蛋白超家族成员），还可能是由3-O-磺基转移酶催化硫酸肝素黏分子而产生的异构体（3-OST-3）。这些结合进一步启动gH、gL，可能还有gK等，与上述蛋白一起，发挥促进介导病毒囊膜与细胞膜融合的作用。
进入细胞后，HSV-1在细胞内向核区域移动，这个过程与微管系统密切相关。首先，进入细胞的HSV-1核衣壳与微管的相关动力蛋白相结合；随后，即循微管网络移向细胞核；在到达核膜时，HSV-1核衣壳则似乎是将所含有的基因组DNA注入细胞核内。
病毒基因组入核后，基因组DNA靶向定位于PML小体。事实上，PML小体具有抗病毒作用，然而病毒的皮层蛋白ICP0 具有E3泛素酶作用，可以破坏PML的结构，释放出病毒可以用于复制的细胞因子（不清楚具体因子是什么）。实验证明，感染细胞的病毒线性DNA很快形成环状的复制中间体。随后，病毒有可能同时以δ复制和θ复制的方式开始DNA复制过程（具体的复制过程咱们后面会说），从而完成病毒基因组DNA的复制。
当病毒基因DNA分子进入细胞核后，将出现一个由宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ复合体介导，并由病毒皮层蛋白VP16启动的转录启动事件。这一事件涉一些胞内蛋白分子，如Oct-1、HCF等，这些细胞蛋白与病毒蛋白形成的聚合体多蛋白复合物，将结合至疱疹病毒基因组中α基因的启动子区域，以顺式激活的方式启动5个α基因产物（以HSV-1为例），即ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47的转录，从而启动病毒基因组线性转录过程。随后，β基因产物开始产生（病毒DNA复制相关酶均为β基因产物），病毒基因DNA分子也开始复制。当γ基因产物（多为结构蛋白）也顺序被转录并翻译形成后，复制完整的基因分子即可作为子代病毒的基因组用于新病毒的装配合成了。
首先合成的ICP0分子通常出现在细胞核内或核结构附近的位置，这些位置相对应的结构点就是ND10。其主要组成成分即为早幼粒细胞白血病蛋白体（PML），而PML又可结合其他在染色体构象调控（如组蛋白乙酰化、去乙酰化）中起作用的蛋白，如Daxx、CBP、sp100等。这些蛋白在与PML结合的过程中可以呈现天然构象或是小分子泛素化修饰的状态。很明显，ICP0在这些部位的聚集及与相关分子的相互作用，提示其可能影响细胞内某些与染色体基因转录相关的调控因子。随着感染细胞内ICP0量的增加，其可逐渐在细胞核内弥散并充满整个细胞核。感染后期，尤其是病毒基因组DNA合成已经完毕后，该蛋白则可在细胞质内检出，这一现象事实上是ICP0通过某种尚未确定的机制（可能是与细胞周期蛋白D3）由细胞核移至细胞质导致的。还有报道认为，ICP0从细胞核移向细胞质的扩散过程中，同时促进了ND10结构的解聚及其组分，如PML、sp100等的降解。（有利于病毒复制）
在ICP0发挥转录激活作用的同时，ICP4对α-0与α-4基因的转录激活则呈现抑制作用。也有实验认为，这是由于ICP4与转录起始复合物的成分TFⅡB结合而导致的。尽管这些资料均未得到统一的结论，但是ICP4作为一种α基因的产物，表现出对早期和晚期基因的转录激活和对α基因的转录抑制，本身就提示α基因产物对β基因和γ基因转录的调控作用。
与ICP0（降解PML以释放转录成分）和ICP4（双重转录调控）不同，HSV-1的ICP27的存在主要是使病毒早期基因和晚期基因的转录本（mRNA水平）在感染细胞中聚集以保证病毒的复制，而将其基因敲除后的突变病毒将无法在感染细胞中实现正常的生长增殖。
HSV编码的ICP47蛋白位于细胞质，它能阻断细胞内的MHCⅠ类分子在内质网及其他细胞器间的转运和成熟。目前机制认为，ICP47作用靶点为TAP1/TAP2复合物。在与ICP47结合后，TAP1/TAP2复合物失去装运蛋白多肽以及结合MHCⅠ类分子的能力。其结果不仅使MHCⅠ类分子结合及呈递抗原多肽的途径受到阻碍，同时还能使未与抗原多头结合的空MHCⅠ类分子迅速降解。在此过程中，可以看到ICP47的特定能力使得HSV感染所可能诱导的免疫反应效率明显受到影响。这一作用为HSV-1感染赢得一定的时间，使其免受免疫系统的攻击。
作为即刻早期蛋白，ICP22也是一个根据不同环境而表现不同功能的调控因子（转录水平）。有报道认为，ICP22可以促进HSV晚期蛋白（γ2）的表达，这似乎是一种正调控作用。但也有实验表明，ICP22可以表现出对多种启动子结构，包括HSV的α、β、γ基因启动子和某些细胞启动子的转录抑制作用。但是，ICP22的抑制...
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