案例简要解析
CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders
背景
SCN2A基因编码钠通道Nav1.2，与神经发育和神经兴奋性密切相关。SCN2A单倍体不足会导致神经环路兴奋性异常，引发自闭症谱系障碍和癫痫等疾病。传统基因治疗难以精准上调剩余野生型等位基因表达，需要开发新型治疗策略。
技术原理
采用CRISPR激活系统，通过dCas9-VP64融合蛋白靶向SCN2A基因启动子区域，利用经筛选验证的sgRNA-（位于转录起始位点上游81 bp）实现高特异性结合，在有效激活基因表达的同时最大限度降低脱靶风险。为确保高效递送与稳定表达，分别构建了AAV-DJ-saCas9-VP64和AAV-DJ-sgRNA两种腺相关病毒载体，通过优化血清型（AAV-DJ）提升转导效率和组织特异性，从而在目标脑区实现协同、持久的SCN2A转录激活。
实验设计
采用多层面策略系统评估基因编辑干预的效果：首先在体外利用Neuro-2a细胞系进行sgRNA转染并通过qPCR筛选出敲低效率最高的sgRNA；随后在体内使用SCN2A+/-杂合子小鼠模型，从出生后30天（P30）开始实验。为实现高效靶向递送，分别采用脑内立体定位注射将CRISPR组件精准导入内侧前额叶皮层（mPFC），以及通过静脉注射系统性给予具有血脑屏障穿透能力的AAV-PHP.eB载体。
干预效果通过多层次指标综合评估包括：mPFC神经元的电生理特性、钙成像记录的神经活动动态、焦虑/认知等相关行为学表现以及目标基因表达水平等分子生物学检测。
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关键步骤
首先进行载体构建，将催化失活的saCas9与转录激活结构域VP64融合形成saCas9-VP64表达元件，并针对SCN2A启动子区域（位于转录起始位点上游−81 bp）设计并优化sgRNA序列（sgRNA-），以确保高特异性结合并降低脱靶风险。随后，将saCas9-VP64和sgRNA分别包装入AAV-DJ血清型腺相关病毒载体，经纯化后测定病毒滴度，确保≥1×10¹³ GC/mL以满足高效中枢递送需求。
在动物实验阶段，对SCN2A⁺/⁻小鼠于P30开始实施立体定位手术，以100 nL/min的恒定流速缓慢注射病毒混合液至mPFC，避免组织损伤并促进局部表达。
术后3–4周依次开展多模态功能检测：
取脑片进行全细胞膜片钳记录，分析动作电位（AP）基本特性及钠电流密度：可评估SCN2A激活是否在单个神经元水平恢复了电压门控钠通道的功能，可定量验证基因激活是否在电生理层面实现功能挽救。
利用双光子显微镜对mPFC神经元进行活体钙成像，采集自发或诱发活动下的ΔF/F信号：可在局部神经环路层面观察神经元群体活动是否恢复正常。
同时结合社交行为测试和PTZ诱导癫痫模型，评估环路功能恢复对整体行为的影响：从整体动物行为层面验证干预的治疗意义。
Fig1 青春期小鼠Scn2a单倍体不足的基因修复
技术创新点
精准激活：仅靶向剩余野生型等位基因避免基因编辑风险；
双模式递送：局部脑注射+全身静脉注射适应不同研究需求；
跨物种验证：小鼠模型+人源iPSC神经元增强临床相关性；
实时检测：电生理-钙成像-行为学闭环验证确保功能挽救。
文献引用
Tamura, S., Nelson, A.D., Spratt, P.W.E. et al. CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders. Nature 646, 983–991 (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09522-w
Nelson, A. D. et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron 112, 1133–1149 (2024).
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