前言
在肿瘤免疫治疗领域，靶向程序性细胞死亡受体1（PD-1）/程序性死亡受体配体1（PD-L1）与靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（CTLA-4）的免疫治疗联合或不联合化疗已被证实相较化疗能够提升抗肿瘤疗效1-3，但患者的长期OS获益仍有限，亟需探索新的治疗模式。Volrustomig是新型PD-1/CTLA-4双特异性抗体，将一个抗PD-1单链可变区片段（scFv）与一个抗CTLA-4 scFv整合于同一抗体骨架，旨在通过优先结合于肿瘤微环境中已激活的PD-1+T细胞，从而在该细胞同步实现CTLA-4的高效阻断4。2025年欧洲肿瘤内科学会免疫肿瘤学大会（ESMO IO）于12月10日至12日在英国伦敦召开。本次大会上公布了两项临床前研究（摘要号：288P与412P）结果，进一步揭示了Volrustomig的作用机制及临床应用潜力5,6，为该药物的临床开发提供了新的实验依据与理论支持。本文基于这两项研究进行深入解读，以供读者参考。
288P：Volrustomig驱动强效的CTLA-4阻断并诱导PD-1持续降解，增强体外T细胞功能
此前，在工程化细胞及超抗原刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）的体外研究中观察到，Volrustomig可通过结合PD-1锚定于T细胞表面，从而增强CTLA-4阻断并可通过双靶点共结合机制，诱导PD-1内吞降解。为进一步阐明Volrustomig的作用机制，研究人员继续开展了系统的体外与离体实验5。
Volrustomig可提升体外肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）干扰素γ（IFN-γ）的分泌水平
将胃癌来源的人肿瘤切片培养物（TSCs）以100nM的Volrustomig进行72小时孵育，随后通过酶联免疫吸附试验（ELLA）检测IFN-γ的分泌情况。同时，将非小细胞肺癌（NSCLC）来源的解离肿瘤细胞（DTCs）与100nM抗CTLA-4抗体、100nM抗PD-1抗体或不同浓度Volrustomig共培养72小时后，通过电化学发光技术（MSD）检测IFN-γ的分泌。结果表明，Volrustomig可增强NSCLC DTCs及胃癌来源TSCs的IFN‑γ分泌（图1）5。
图1. Volrustomig可增强NSCLC DTCs及胃癌来源TSCs的IFN‑γ分泌
Volrustomig可在体外与离体条件下持续诱导PD‑1降解
在NSCLC DTCs的离体模型中，将肿瘤组织解离后，分别使用Volrustomig或抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体的联合制剂处理72-96小时，随后通过流式细胞术对调节性T细胞（Tregs，CD4+/FOXP3+）、常规CD4+T细胞（CD4+/FOXP3-）以及CD8+T细胞进行总PD-1蛋白的定量分析。结果显示，Volrustomig处理可导致CD8+T细胞、常规CD4+T细胞及Tregs表面的PD-1蛋白表达呈现剂量依赖性下降（图2），且该降解效应在T细胞经历多轮抗原再刺激后依然得以维持（图4）。相比之下，联合制剂未观察到显著的PD-1降解现象。值得注意的是，PD-1降解程度在不同细胞亚群中存在差异，其强度依次为Tregs>常规CD4+T细胞 > CD8+T细胞（图3）5。
图2. Volrustomig可在体外诱导NSCLC肿瘤TILs发生剂量依赖性PD-1降解，而抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体联合制剂则无此作用
图3. PD-1降解程度在Tregs中最强>常规CD4+T细胞 > CD8+T细胞[直方图展示了在10nM Volrustomig及联合制剂处理下的PD-1表达水平；相邻点图显示了来自4个样本的平均值±标准误（非配对t检验）]
图4. Volrustomig在体外和离体再刺激实验中可诱导PD-1的持续降解[示意图描述了再刺激实验方案，并通过方差分析（ANOVA）评估了外周血单个核细胞（中图）及基于树突状细胞（右图）测定中的总PD-1表达水平]
Volrustomig在离体条件下优先结合表达PD‑1的TILs
研究人员还对NSCLC与结直肠癌（CRC）来源的DTCs进行了AF488标记的Volrustomig染色与免疫表型分析。进一步的分析聚焦于CD4+与CD8+T细胞亚群，根据细胞表面PD-1与CTLA-4的共表达情况，将来自NSCLC与CRC DTCs的T细胞进行细分。数据显示，在TILs中，PD-1与CTLA-4双阳性亚群所表达的PD-1水平高于仅表达PD-1的亚群，从而导致Volrustomig在该群体中的结合更强（图5）。此外，Volrustomig在TILs上的结合强度与PD-1的表达水平显著相关，而与CTLA-4的表达无关（图6）5。
图5. 与PD-1+CTLA-4-TILs相比，PD-1+ CTLA-4+TILs表达更高水平的PD-1，从而导致更高的Volrustomig结合[通过对PD-1与CTLA-4表面表达进行设门，分选出NSCLC（紫色）和CRC（红色）患者树突状细胞中的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞，并绘制了PD-1及Volrustomig-AF488的平均荧光强度（MFI）（配对t检验）]
图6. Volrustomig在TILs上的结合与PD‑1显著相关，而与CTLA‑4不相关[图为CRC样本的代表性流式图，展示了PD-1、CTLA-4的表达与Volrustomig-AF488结合情况之间的相关性，相关系数基于6个样本计算得出（Pearson相关系数）]
Volrustomig可协同结合TILs上的CTLA‑4，与抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体的联合制剂相比，可提供更高的CTLA‑4受体占位率
受体占据分析表明，在NSCLC DTCs中，经Volrustomig或抗PD-1与抗CTLA-4联合制剂处理30分钟后，采用荧光标记的竞争性抗体检测并利用流式细胞术定量测定Tregs、常规CD4+T细胞及CD8+T细胞表面的“游离”PD-1与CTLA-4水平。结果显示，相较于抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体联合制剂，Volrustomig在Tregs、CD4+及CD8+T细胞上均能实现更低的“游离”CTLA-4水平，展现出更优的CTLA-4通路阻断效能5。
图7. Volrustomig与TILs上的CTLA-4协同结合[滴定曲线展示了一个代表性样本的技术重复结果，IC50数据基于4个样本得出（配对t检验）]
以上发现共同说明，Volrustomig作为一种同时靶向PD-1与CTLA-4的双特异性抗体，通过PD-1介导的锚定作用，优先结合于TILs表面，而后协同结合CTLA-4。这一靶向特性不仅能够诱导TILs上的PD-1发生降解，且与抗PD-1/抗CTLA-4单抗联合疗法相比，可诱导更强的CTLA-4阻断效应，为其临床转化提供了理论支撑。
412P：Volrustomig协同结合PD-1与CTLA-4，并在肿瘤抗原特异性T细胞中诱导PD-1降解
为在更贴近生理环境的肿瘤抗原特异性场景中验证Volrustomig的作用机制，本研究从健康供体PBMCs中诱导生成黑色素瘤相关抗原1（MART1）特异性T细胞，构建肿瘤抗原特异性模型。利用荧光标记的Volrustomig及竞争性抗CTLA-4抗体，通过流式细胞术分析了PD-1表达对其结合及CTLA-4阻断功能的影响；采用Incucyte活细胞成像系统评估了抗原特异性杀伤效率，并辅以细胞因子检测以全面评价T细胞功能变化；此外，通过蛋白质印迹与流式细胞术从蛋白水平检测了PD-1的降解情况6。
Volrustomig在抗原特异性T细胞上以PD‑1为锚定，并协同结合CTLA‑4
流式细胞术分析评估了Volrustomig与预阻断PD-1或CTLA-4的MART1特异性扩增T细胞的结合情况，结果显示，当PD-1被阻断时，Volrustomig的结合减少，而CTLA-4的阻断则对其结合无影响，表明Volrustomig主要通过锚定PD-1来发挥作用（图8）6。
图8. 流式细胞术评估Volrustomig与PD-1或 CTLA -4预阻断的MART-1扩增T细胞的结合情况[通过Dextramer染色法鉴定抗原特异性CD8+T细胞（CD8 DEX+），经预阻断的实验组数据以未阻断T细胞为基准进行归一化，并以倍数变化表示；样本量N=4，采用配对单因素方差分析进行统计检验，统计显著性标注如下：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.005]
进一步的功能分析显示，当PD-1未被阻断时，Volrustomig能更有效地阻断表面CTLA-4的表达，强调了PD-1在Volrustomig介导的CTLA-4阻断中的关键作用（图9）6。
图9. 流式细胞术评估Volrustomig对PD-1预阻断或未阻断的MART1扩增T细胞中CTLA-4的阻断作用[对4名健康供体的MART-1扩增T细胞进行预处理：一组使用a-PD-1抗体（绿色标记），另一组不作处理（蓝色标记），并通过流式细胞术检测Volrustomig介导的CTLA-4阻断效果；采用Dextramer染色法鉴定抗原特异性CD8+T细胞（DEX）；CTLA-4表面减少百分比通过Volrustomig处理的MART-1扩增T细胞计算得出。样本量N=4，采用配对单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01]
Volrustomig与PD‑1的结合对于增强抗原特异性杀伤活性至关重要
抗原特异性杀伤效率评估实验观察到，预先阻断PD-1会减弱Volrustomig对抗原特异性杀伤的增强作用，并降低IFN-γ和颗粒酶B的释放，进一步证实了PD-1在Volrustomig功能机制中的重要性（图10）6。
图10. Volrustomig阻断PD-1对靶向杀伤及细胞因子释放的功能增强作用分析[从4名健康供体获取的MART-1扩增T细胞，经a-PD-1预先阻断（绿色）或不做处理（蓝色），随后与自体单核细胞及表达MART-1-GFP的肿瘤细胞进行共培养；通过Incucyte系统动态监测GFP信号减弱以评估抗原特异性杀伤效应，并收集上清液进行细胞因子检测；以未经阻断的T细胞为基准进行标准化，计算预处理组数据的倍数变化。实验独立重复4次，采用配对单因素方差分析，* p<0.05]
与抗PD-1抗体及抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体联合制剂相比，Volrustomig可通过在抗原特异性T细胞上协同结合PD‑1与CTLA‑4，诱导PD‑1降解
进一步研究发现，在抗原特异性模型体系中，与抗PD-1抗体及抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体联合制剂相比，Volrustomig能够协同结合T细胞上的PD-1与CTLA-4，并介导PD-1的降解，但不影响CTLA-4的表达。该结论已通过蛋白质印迹（图11）与流式细胞术（图12）得到证实6。
图11. 蛋白质印迹法（Western blot）评估Volrustomig介导的PD-1降解作用[将4名健康供体的MART-1扩增T细胞与MART-1肽（5μg/mL）及肿瘤细胞共培养；培养物分别经抗PD-1抗体、抗PD-1抗体与抗CTLA-4抗体联合制剂或Volrustomig处理；收集T细胞裂解液用于总PD-1评估。Western blot结果代表2名供体的样本结果]
图12. 流式细胞术评估Volrustomig介导的PD-1降解作用[将4名健康供体的MART-1扩增T细胞与MART1肽（5μg/mL）及肿瘤细胞共培养；通过流式细胞术定量检测细胞内PD-1和CTLA-4水平；细胞内PD-1的倍数变化值以未处理T细胞为基准进行归一化计算。样本量N=4，配对单因素方差分析*p<0.05，**p<0.01]
综上所述，本研究在人类抗原特异性免疫模型中进一步证实了Volrustomig通过PD-1锚定协同结合CTLA-4以增强CTLA-4阻断的功能机制，并阐明了该机制在促进T细胞抗原特异性杀伤与细胞因子释放中的关键作用。尤其重要的是，研究揭示了Volrustomig特有的PD-1降解能力，这进一步从作用机制上将其与传统的抗CTLA-4/抗PD-1抗体或二者联合方案区分开来，为其在临床开发中的差异化价值提供了关键临床前依据。
总结及展望
上述证据共同表明，Volrustomig凭借其独特的PD-1/CTLA-4双特异性结构，通过“PD-1锚定”机制在肿瘤微环境中实现CTLA-4的高效选择性阻断，并诱导PD-1持续降解。这一作用机制的临床转化前景已获得初步研究数据的支持。在晚期非鳞NSCLC一线治疗中，一项Ib/II期研究显示（NCT03530397），Volrustomig联合化疗相比帕博利珠单抗联合化疗，延长了中位缓解持续时间（20.5个月 vs 9.9个月），并在PD-L1＜1%的患者中表现出更高的客观缓解率（ORR，55.6% vs 44.4%）7。2024年世界肺癌大会(WCLC)上公布的数据显示，Volrustomig联合化疗在非鳞状细胞癌(n=119)和鳞状细胞癌(n=20)队列的ORR分别为43.7%和65.0%，疾病控制率（DCR）分别为84.9%和95.0%8。目前，针对该药物的多项关键III期临床试验，包括eVOLVE-Lung02、eVOLVE-HNSCC及eVOLVE-Meso等已全面展开，旨在进一步评估该药物在肺癌、头颈部鳞状细胞癌及恶性胸膜间皮瘤等多种实体瘤中的疗效与安全性。展望未来，随着这些关键临床试验数据的披露，Volrustomig有望为肿瘤免疫治疗提供一种新的双特异性抗体疗法，并为该类药物的研发与临床应用确立新的方向。
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审校：Leon
排版：Zelda
执行：Atai
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