生物系统的内在复杂性与异质性，使得解析生命基本原理日益依赖于能够提供廉价、高精度单细胞与单分子分析的工具与方法。尽管已有多种平台技术可用于单细胞基因组、转录组和表观基因组分析，但现有方法存在显著局限。例如，基于液滴微流控的高通量方法通常局限于“一锅法”反应，无法在过程中更换试剂；而微孔板虽灵活，却通量有限、体积大、操作繁琐。理想方案需兼具液滴微流控的通量优势与微孔板平台的灵活性。
近日，立陶宛维尔纽斯大学Linas Mazutis教授课题组提出了一种基于半透膜胶囊的通用型高通量单细胞组学技术。该技术利用半透膜胶囊，可灵活应用于多种高通量核酸分析，包括单细胞基因组与mRNA测序，以及基于特定核酸标记、通过荧光激活细胞分选技术分离单个转录组。SPCs具有良好的生物相容性，支持单细胞的长期培养与克隆扩增，从而克服了液滴微流控平台的一个根本性限制。总体而言，SPCs为基于多步生化反应的、易于使用且可扩展的单细胞组学应用提供了一个可定制的通用工具。相关论文以“High-throughput single cell omics using semipermeable capsules”为题，发表在
Science上。
半透膜胶囊是由多孔薄壳包裹的微型液体腔室。研究人员利用微流控技术与由高分子量葡聚糖和甲基丙烯酰化明胶组成的水性两相系统生成SPCs。通过调整微流控设备流速和GelMA浓度，可精确调控胶囊尺寸（35-260微米）与壳层厚度。SPCs具有出色的机械稳定性，可耐受常规实验室操作。其关键特性在于能够完全保留大于300 bp的核酸片段，同时允许小于约200 kDa的蛋白质和试剂自由扩散，这为在常规实验室试管中进行复杂的多步核酸分析（如单DNA分子数字PCR、单细胞RT-PCR、单基因组扩增和全基因组测序）提供了可能，同时保持了单细胞或单分子分辨率。
图1. 半透膜胶囊的生成与特性。 (A) SPCs概念图：类似于透析膜的薄半透壳包裹的微观液滴，壳层允许试剂、寡核苷酸和酶通过，但能有效保留长核酸分子。(B) 利用微流控和ATPS生成SPCs。相分离后，GelMA形成外壳，经冷却（物理交联）和光聚合（化学交联）固化。(C) 荧光标记明胶制备的SPC共聚焦图像，绿色显示包裹液体核的薄外层。(D) 悬浮于PBS中并携带单个细胞的SPC明场图像。(E) SPC在22°C下4小时内对核酸片段的大小依赖性保留。(F) SPC在22°C下对不同分子量生物分子（0.33 kDa荧光素，20 kDa FITC-葡聚糖，66 kDa BSA，160 kDa FITC-IgG）的渗透性。(G) SPC与0.1 µM FITC-BSA在22°C孵育3分钟后的荧光图像。(H) SPC与0.2 µM FITC-葡聚糖在22°C孵育60分钟后的荧光图像。比例尺：20 µm。
图2. 使用SPCs进行核酸分析的应用示例。 (A) 对封装在SPCs中的细胞进行核酸分析的概念图。(B) 通过数字胶囊PCR进行单DNA分子扩增与分析（SYBR Green I染色）。(C) 靶向CD45、YAP和ACTB转录本的多重单细胞RT-PCR。(D) 通过phi29 DNA聚合酶对K-562细胞进行单基因组扩增，SYTO染料染色（黄色）。(E) 267个测序细胞中随机选取的5个人类淋巴母细胞单细胞全基因组测序圈图。比例尺：50 µm。
除了核酸分析，SPCs还支持细胞的长期生长，克服了液滴微流控的主要限制。如图3所示，无论是悬浮细胞还是贴壁细胞，均可在SPCs内进行长达数天至数周的培养，形成单细胞衍生的球状体。胶囊的弹性外壳可随细胞增殖而膨胀超过两倍而不破裂。通过胶原酶温和处理，可快速分解蛋白质外壳，释放出完整的细胞球体，且不影响细胞活性。 包被细胞还可被冷冻保存，后续仍能有效扩增为球体。
图3. 使用SPCs形成单细胞衍生球体。 (A) 将封装细胞扩增为球体的通用策略示意图。(B) SPCs支持悬浮细胞（上排）和贴壁细胞（下排）的长期培养。(C) 通过添加胶原酶[E]释放封闭在SPCs中的球体。(D) 培养1周后，使用活/死染色评估封闭在SPCs中的HCT116球体细胞活力（N = 155）。(E) 不同细胞系在5至14天内形成的单细胞衍生球体。(F) A549细胞冷冻保存后的球体形成。(G) A549细胞冷冻保存前后的活力。比例尺：50 µm。
作为SPCs的一项重要应用，研究人员开发了名为CapSeq（基于胶囊的RNA测序）的单细胞转录组学方法。该方法通过拆分-合并条形码策略，可实现一次运行中对超过10万个单细胞进行条形码标记。CapSeq优化了逆转录反应与条形码步骤，在测试中平均每个细胞可检测到超过10,000个转录本和3,000个基因。特别值得注意的是，CapSeq采用严苛裂解条件，成功捕获了传统方法难以回收的中性粒细胞等脆弱细胞类型，转录本回收率提高了3倍以上，展现出对敏感细胞类型极高的检测灵敏度。
图4. CapSeq用于高通量单细胞转录组学。 (A) CapSeq工作流程：裂解、纯化、组合条形码标记、文库制备、测序。(B) CapSeq在K-562细胞系上的性能（UMI/细胞）。(C) 在不同裂解条件下，健康供体白细胞中中性粒细胞回收率的箱线图。(D) CapSeq与已发表方法在中性粒细胞基因捕获数量上的比较。
研究人员利用CapSeq对急性髓系白血病患者的白细胞进行了单细胞转录组分析，构建了包含86,447个转录组的综合细胞图谱。分析揭示了AML患者中不同的白血病细胞表型，这些表型在不同患者间共享，并与临床风险分类相关。研究还发现，AML患者的成熟先天免疫细胞（如中性粒细胞、单核细胞）表现出功能失调和类干细胞的异常状态，共享一组通常与白血病祖细胞/干细胞状态相关的基因（如IGF2BP2, FLT3, MEIS1）的上调，表明这些成熟细胞可能处于功能改变的状态。
图5. 使用CapSeq对造血疾病进行转录分析。 (A) AML、中性粒细胞减少症、G-CSF治疗及健康个体白细胞转录组UMAP图，按注释细胞表型着色。(B) 白血病区室的力导向图布局。(C) Hallmark通路的基因集富集分析。(D) 比较AML患者与健康供体时，先天免疫细胞类型间共享差异表达基因的UpSet图。(E) AML患者与健康供体髓系细胞中所有显著差异表达基因的火山图。
为了展示SPC技术超越常规scRNA-seq应用的广泛用途，研究团队将CapSeq与单细胞RNA细胞计数术相结合，开发了一种基于RNA标记表达来富集并测序单细胞转录组的通用策略。以在AML中上调的lncRNA MIR181A1HG为例，研究人员对封装后的细胞进行靶向荧光PCR，随后利用FACS分选荧光阳性胶囊。测序结果证实，该方法能有效富集MIR181A1HG阳性的白血病原始细胞，展示了SPC技术在基于缺乏合适抗体的核酸标记进行表型分选与测序方面的潜力。
图6. 基于靶向核酸标记通过FACS富集单细胞转录组。 (A) AML细胞与所有其他细胞相比，前100个差异表达基因的基因生物型分布。(B) 单细胞转录组UMAP图，按MIR181A1HG、LNCAROD和LINC02147表达着色。(C) AML细胞与所有其他细胞相比的差异表达基因，按差异表达和统计学显著性的综合评分排序。(D) 基于目标核酸标记分选和测序单细胞转录组的实验策略。(E) 四位AML患者单细胞转录组在基于MIR181A1HG表达分选前（左）和分选后（右）的UMAP图，按细胞类型着色。(F) 基于MIR181A1HG表达的转录组分选后，阳性与阴性组分间细胞类型的差异丰度分析。
综上所述，这项研究提出了一种基于半透膜胶囊的、广泛适用的高通量单细胞组学研究平台。该技术利用微流控高通量封装单细胞，但后续所有步骤均可脱离微流控设备，使用标准实验室移液器和试管完成，易于采纳和实施。SPCs兼具水凝胶珠的溶剂交换便利性，又避免了核酸在聚合物网格中的物理截留问题，使核酸在液态核内自由分散，大幅提升了捕获效率。其优异的生物相容性支持长期细胞培养与克隆扩增，并通过酶解释放实现细胞回收。此外，基于RNA标记的转录组分选策略为稀有细胞状态研究提供了新途径。与现有液滴或微孔板方法相比，SPC技术提供了更大的灵活性、可扩展性和易用性，确立了其作为下一代单细胞多组学研究的通用平台地位。
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